抗菌消炎妇科中药的筛选及临床前实验研究

左春连+韩成云+刘智凯+晏渠如

[摘要]目的 探討妇科生殖系统感染的治疗药物，筛选抗菌消炎效果特别显著的中药。 方法 选择抗菌消炎的4种中药：树参、藤石松、松萝和石仙桃，分别用水提法和醇提法提取其组分，将其提取物配为相同浓度的溶液，分组为中药处理组（n=25）和水CK1、乙醇CK2对照组（n=25）。培养大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和产气大肠埃希菌，采用管碟法测定中药提取液的抑菌圈，评价抑菌效果。结果 4种中药水提液中，抑菌效果最好的是藤石松，对3种细菌的抑制效果都很明显，与对照组差异有统计学意义（P<0.01），树参对金黄色葡萄球菌的抑制效果较强，抑菌效果与对照组差异有统计学意义（P<0.05），其次是松萝，与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。4种中药醇提液中，抑菌效果最好的是树参，对3种菌的抑制效果都很明显，与对照组差异有统计学意义（P<0.05），树参和松萝的醇提液抑菌效果几乎相当，与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 树参和松萝醇提液、藤石松水提液的抑菌效果显著，适合在妇产科临床上外用，树参的水煎煮汁液口服，临床上均有抗菌消炎效果。

[关键词]妇科炎症；树参提取物；藤石松提取物；抗菌消炎；筛选

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）12（c）-0121-04

Screening of Chinese herbal medicine for antibacterial anti-inflammatory in department of gynaecology and preclinical experimental study

ZUO Chun-lian1 HAN Cheng-yun2 LIU Zhi-kai2 YAN Qu-ru2

1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Yuanzhou District Maternal and Child Health Hospital in Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Yichun University in Jiangxi Province，Yichun 336000，China

[Abstract]Objective To study the drug of treating gynecological reproductive system infection，and screen the Chinese herbal medicine with very good antibacterial anti-inflammatory effect.Methods Four kinds of Chinese herbal medicines were selected as the antibacterial and antiphlogistic drugs：Dendropanax dentiger Merr.，Lycopodium japonicum Thunb，Usnea diffracta Vain，Pholido-ta cantonensis Rolfe.They were extracted by water extraction and ethanol extraction，and then they were mixed into the same concentration solution.The group was the treatment group of Chinese herbal medicine （n=25），and water CK1 and ethanol CK2 control group （n=25） respectively.Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Staphylococcus aureus were Cultured，and the bacteriostatic ring was determined of Chinese herbal medicine extract by tube plate method to evaluate the bacteriostatic effect.Results Among 4 kinds of water extract of Chinese herbal medicine，Lycopodium japonicum Thunb had the best bacteriostatic effect，and it had a very obvious bacteriostatic effect for 3 kinds of bacteria，and there was a statistical difference compared with control group （P<0.01），and bacteriostatic effect of Dendropanax dentiger Merr.was stronger for Staphylococcus aureus，and there was a statistical difference of bacteriostatic effect compared with control group （P<0.05），Usnea diffracta Vain was following，and there was a statistical difference compared with control group （P<0.05）.Among 4 kinds of alcohol extract of Chinese herbal medicine，Dendropanax dentiger Merr.had the best bacteriostatic effect，and it had a very obvious bacteriostatic effect for 3 kinds of bacteria，and there was a statistical difference compared with control group （P<0.05），and bacteriostatic effect of alcohol extract for Dendropanax dentiger Merr. and Usnea diffracta Vain was almost quite，and there was a tatistical difference compared with comtrol group （P<0.05）.Conclusion Bacteriostatic effect of alcohol extract of Dendropanax dentiger Merr.and Usnea diffracta Vain and the water extract of Lycopodium japonicum Thunb is obvious which is suitable for external use in clinical obstetrics and gynecology.Oral water decoction juice of Dendropanax dentiger Merr. for oral admina has an antibacterial anti-inflammatory in clinic.

[Key words]Gynecological inflammation；Dendropanax dentiger extract；Lycopodiastrum casuarinoides extract；Antibacterial anti-inflammatory；Screening

孕产妇生殖道感染为常见的妇科疾病。妇科炎症如果没有及时控制，可能导致流产。在孕产妇分娩时及产褥期病原体对生殖道侵袭后，造成局部或全身感染，并由此引发全身炎症反应综合征，造成产褥感染。目前主要治疗药物仍然为抗生素。然而，近年来随着抗生素特别是各种广谱抗生素的大量使用，细菌的不断变异，菌群分布及耐药性也出现了较大的变化。

对妇科慢性宫颈炎、盆腔炎等细菌性炎症的临床药物治疗，西医治疗妇科慢性盆腔炎往往难以奏效，而中医中药的治疗有其独特的优势。近几年来，报道了不少中药治疗慢性盆腔炎的有效方剂及方法。

本研究对树参、藤石松等4种中药进行抗菌筛选实验，为妇科感染病原细菌治疗提供可靠有效的天然药物。采用中药进行孕产妇生殖道感染预防和抗菌消炎，中药相对于抗菌素和激素类药物，对胎儿发育的影响和风险降低，具有安全、疗效好和经济实用的优点。

1仪器与材料

1.1 供试菌种

大肠埃希菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Sa），产气大肠埃希菌（E. coli-aerogenes group）

1.2 供试药用植物

树参（Dendropanax dentiger Merr.）茎组织，藤石松（Lycopodium japonicum Thunb）茎和针叶，松萝（Usnea diffracta Vain）、石仙桃（Pholido-ta cantonensis Rolfe）全株。

1.3 实验仪器

数显恒温水浴器（HH-4）国华电器；气浴恒温摇床（THZ-820）国旺仪器；冰箱（容声BCD-185DKA）；超净工作台（SW-CJ-1FD）苏净安泰；生化培养箱（SPX-250B-Z）上海博讯实业有限公司；立式压力蒸汽灭菌器（LS-50HJ）江阴滨江医疗设备有限公司；超纯水器（UPWS-I-10T）杭州永洁达净化有限公司；电磁炉（GCA16）珠海格力小家电有限公司， 牛津杯、试管、培养皿、移液枪、量筒、烧杯、开口瓶、接种环、千分尺等。

1.4 培养基

LB液体培养基：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g， 加纯净水至1000 ml，调节pH值达7.0。

LB固体培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、NaCl 10 g、琼脂15～20 g，加纯净水至1000 ml，调节pH值达7.0，高温高压灭菌，制作培养基。

2方法与结果

2.1制备中药提取物

2.1.1药用植物水提液的制备 称取每种供试植物干品20 g，绞碎后置电磁炉（GCA16）中，加超纯水 500 ml，浸泡4 h后，用小火煮 30 min，过滤，离得上清液，残渣再加 500 ml 水煮 30 min，合并滤液，加热浓缩至 50 ml。水提液置立式压力蒸汽灭菌器（LS-50HJ）中高温高压（120℃，30 min）灭菌后放入超净工作台备用。

2.1.2药用植物醇提液的制备 称取每种供试植物干品5 g，绞碎后分别置带塞广口瓶中，加入75%乙醇100 ml浸泡48 h，经过滤离心，滤液用旋转蒸发仪浓缩至5 ml（浓度为1 g/ml），醇提液经微孔滤膜（0.22 μm）除菌后放入超净工作台备用。

2.2细菌培养基的制备

将培养皿和试管用报纸包好，按照配方配制好固液培养基，然后一同放入高压灭菌锅中灭菌，固体培养基倒入培养皿中制作平板，液体配基倒入试管中。

2.3菌悬液的制备

用平板画线法将金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、产气大肠埃希菌分别接种于LB固体培养基上，用封口膜封好，37℃置生化培养箱中培养24 h活化细菌，活化后，用接种环挑取同一菌落的细菌，接种于装有LB液体培养基的试管内，然后置于气浴恒温摇床中37℃培养48 h用作实验菌种。

2.4抑菌试验

2.4.1提取物抑菌效果的测定 实验菌种培养好以后，在超净工作台上开始抑菌实验。将实验菌种摇匀，用移液枪移取50 μl菌悬液于制好的平板上，平铺涂匀，3种实验菌，每种涂30个平板，然后将已灭菌的牛津杯等间距置于琼脂表面上，每皿4个，全部排好之后，在超净台上静放10 min。用1 ml灭菌移液枪吸取目标植物水提取液200 μl，注入摆好的牛津杯中，每皿中3个牛津杯注入同种药物，另一牛津杯注入灭好菌超纯水200 μl作对照，然后用封口膜小心的封好。每种药物对应每种细菌分别做平板，共25个平板做水提药（n=25）抗菌，用纯净无菌水为对照组CK1，同样25个平板做醇提药液（n=25）（以75%乙醇100 ml浓缩至5 ml为对照液CK2）。之后置于37℃生化培养箱内培养24 h后观察培养皿内的细菌生长情况，并用千分尺对应测量各个处理组和对照组抑菌圈的直径。各处理组与对照组CK1 和CK2分别进行数据的统计比较数据采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2.4.2 不同浓度提取液对抑菌作用影响的测定 以提取液作为100%原液，无菌水2倍法稀释，得1∶2、1∶4、和1∶8浓度的提取液系列。由于两种方法的提取液对细菌的抑制效果各有不同，因此分别选取两种抑制效果比较明显的提取液做稀释实验。每一系列都分别接菌并作对照，摆好牛津杯并注入等体积药物，置37℃恒培养24 h，再测定抑菌圈的大小并记录，有效果记为“+”，没有效果记为“-” ，與对照组CK1 和CK2比较抑菌效果。

2.5实验结果

2.5.1管碟法测定的植物提取液抑菌圈大小 将一个培养皿中3个药物的抑菌圈效果取平均值，并且数据精确到小数点后一位，水提液对照组和醇提液对照组分别去掉最高值和最低值求均值，所得数据绘制表格，由图1结果可知，4种中药水提液中，抑菌效果最好的是藤石松，对3种细菌的抑制效果都很明显，与对照组差异有统计学意义（P<0.01），其次松萝的抑菌效果与对照组差异有统计学意义（P<0.05），枫荷梨（树参）对金黄色葡萄球菌的抑制效果较强，藤石松对产气大肠埃希菌的抑制效果较强，与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。其他对大肠埃希菌和产气大肠埃希菌的抑制效果不明显；4种中药醇提液中，抑菌效果最好的是枫荷梨（树参），对3种菌的抑制效果都很明显，与对照组差异有统计学意义（P<0.05），藤石松对金黄色葡萄球菌、树参和松萝的醇提液（抑制效果几乎相当）对产气大肠埃希菌有抑制效果，与对照组差异有统计学意义（P<0.05），表明有抑制效果；其他结果数据差异无统计学意义（P>0.05），表明无抑制效果。

2.5.2管碟法测定的植物提取液稀释后抑菌圈大小 根据表1、表2的结果，这几种中药提取物对细菌的抑制效果，在降低植物提取液浓度达到最低阈值时（1∶8稀释浓度），4种中药提取物均没有抑菌效果，树参、藤石松在稀释为1∶2、1∶4时，仍然对全部实验菌株有抑菌效果，松萝（醇提液）稀释为1∶2时对全部菌株有抑菌效果。

3讨论

孕产妇下生殖道感染是女性常见的妇科病，孕期体内的激素水平升高，同时孕期机体的免疫功能低下，均增加了孕期下生殖道感染的风险，对产妇产褥感染的病原体分布情况及其耐药性进行分析，发现产褥感染大肠埃希菌比例最高[1]。孕期下生殖道感染没有给予积极有效的治疗，往往容易上行感染，导致胎膜早破的发生，生殖道感染引起胎膜早破时增加宫腔感染、产褥感染以及新生儿感染率，生殖道支原体、衣原体、真菌、细菌性感染是胎膜早破的诱发因素[2]，因此对下生殖道感染及时的诊断治疗对预防胎儿早产、胎膜早破的发生、降低母儿不良妊娠结局、降低围生儿死亡率均具有重要意義。

对主要病原体的药敏试验发现，主要病原体对常见抗生素如青霉素、庆大霉素、红霉素、哌拉西林-舒巴坦等，出现较大程度的耐药性，以混合感染现象增多以及菌群耐药性增高为特征，出现了对大部分抗生素甚至全部抗生素耐药的菌群[1，3]，给感染性疾病的临床治疗带来新的用药危机。

中药治疗妇科疾病有着悠久历史与确切的疗效[3]，《神农本草经》明确指出治疗妇产科药物达五十余种[4]。中国药典收载了较多抗菌解热作用的中药，常用中药连翘有广谱抗菌作用，为木犀科连翘属植物连翘（Forsythia suspense Thunb. Vahl）的干燥果实，连翘的抗菌主要成分为连翘酚及挥发油，对金黄色葡萄球菌等有很强的抑制作用和抗菌解热作用[5-7]。又如女贞子（Ligustri Lucidi Fructus）系木犀科女贞属植物女贞（Ligustrum lucidum Ait.）的干燥成熟果实。中医将女贞子列为上品，应用了几千年，研究表明其药理作用主要有抗炎抑菌、升高白细胞和增强非特异性免疫、免疫调节等功效，具有抗炎、抗微生物等药理作用[8]，临床用作抗皮肤炎症的中药。

树参为五加科Araliaceae树参属Dendropanax植物，又名枫荷梨，含有多种结构类型的化学成分，主要为多炔类、萜类、皂苷、挥发油等，用于瘫痪、偏头痛、臂丛神经炎、风湿性及类风湿性关节炎的治疗[9-10]，其对常见大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌抗菌作用研究很少报道。有研究分析树参抗菌主要成分为生物碱等，对金黄色葡萄球菌等有很强的抑制作用[11]。对藤石松、垂穗石松（Palhinhaea cernua）等4种药用植物分离得到60个生物碱类化学成分，进行了体外的抗炎活性测试，结果表明有2个化合物显示了很好的抗炎活性，其中1个化合物的抗炎活性为阳性药半抑制浓度（IC50=42.6 μmol/L）的2倍， 其IC50分别为25.5 μmol/L和41.5 μmol/L，另一个的抗炎活性与阳性药几乎相同[12-13]。

松萝中的松萝酸是松萝抗菌作用的主要活性物质，有很强的抗菌作用，对结核杆菌及革兰阳性菌的抑制作用最强，对金黄色葡萄球菌及革兰阴性菌中的百日咳、枯草、肺炎、大肠埃希菌和变形杆菌亦有效[14-15]。松萝酸对耐药金黄色葡萄球菌及肠球菌有效；松萝中除含有松萝酸外，还含有其他多种药理活性成分，金黄色葡萄球菌对花松萝的乙酸乙酯的提取物均较敏感，最低抑菌浓度为12.5 g /L；大肠埃希菌对花松萝的乙醇提取物很敏感，最低抑菌浓度25 g/L；研究报道，对金黄色葡萄球菌耐药质粒有消除作用[16]，作用24 h的消除率5.2 %，延长作用时间至48 h，消除率可达14.6 %。

石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.）为兰科植物的假鳞茎或全草，属中是兰科植物，别名石橄榄、石上仙桃和石莲，石仙桃不同溶剂的提取物对不同细菌具有抑制作用，石仙桃氯仿提取物对表皮葡萄球菌抑制，乙酸乙酯提取物对消化链球菌，正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌、淋病奈瑟球菌、表皮葡萄球菌、消化链球菌等都有抑制作用[17]，水提取物对金黄色葡萄球菌有较好的抑制作用，其最低抑菌浓度为80 mg/ml类成分[18]。

要想发挥中药的抑菌效果，需要控制一定浓度，当浓度低于极限阈值时无抑菌作用，而可能会导致误认为中药没有抑菌效果。同时发现，同一种中药提取液可能对几种细菌有广谱的抑制作用，可见是提取液中含有的某种成分或多种物质对细菌的生长、繁殖发挥的抑菌效果，这一点有待于更深入的研究。

本实验用管碟法对4种中药的醇提液和水提液进行了抑菌活性的研究，是筛选开发临床用中药的前提和基础，而筛选鉴定其中的杀菌成分是抗菌消炎中药研究的重要方向，旨在为分离鉴定植物源抗菌先导化合物提供依据。本研究结果表明，对比4种中药的抗菌作用研究， 其大致相同的抗菌谱，需要应用现代药学和药理学大量研究证实抗菌中药及其有效成分。

本实验探讨治疗妇科慢性盆腔炎和产褥感染的有效方剂及方法，通过抗菌中药的实验研究表明，采用抗菌中药制剂藤石松和松萝外用，树参口服进行预防和治疗，克服病原菌耐药性问题。药用植物种类繁多，资源丰富，环保无副作用等特点，因此研究价值高，发展潜力大。

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