荔枝果实对霜疫霉侵染抗性评价体系建立及初步应用

曹璐璐 孙进华 王家保

摘 要 为建立稳定的荔枝果实对霜疫霉侵染抗性评价体系，研究不同浓度孢子囊悬浮液浸染、不同症状调查时间对不同荔枝品种病情指数的影响，并用建立的方法研究部分荔枝品种对霜疫霉侵染抗性的初步评价。结果表明：以4×104个/mL孢子囊浓度悬浮液为接种浓度，‘妃子笑和‘大丁香离体果实病征发生速度适中，侵染第72小时的病情指数比较稳定，能够更好地区分品种间的抗病性差异。2012～2016年，用该指标体系先后评价了15个荔枝品种对霜疫霉侵染的抗性，结果发现不同年份这些品种的抗性分级基本相同，‘黑叶和‘桂味是表现最为稳定的抗病和感病品种，证实了建立的抗性评价体系的稳定性。

关键词 荔枝；荔枝霜疫霉菌；抗性；评价体系

中图分类号 S436.671 文献标识码 A

Establishment and Preliminary Application of the Resistance

Evaluation System of Litchi Fruit to Downy Blight

CAO Lulu1，2， SUN Jinhua2， WANG Jiabao2 *

1 College of Environmental and Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract In order to establish a stable resistance evaluation system of litchi fruit to downy blight， the influence on disease index（DI）of concentration of inoculation sporangia and time of record for symptom were studied among different litchi germplasms. The results showed that the disease symptom of‘Feizixiaoand‘Dadingxianginoculated with 4×104/mL sporangia occurred at moderate speed， and the disease index of 72 h was relatively stable， which was a proper time of symptom survey for resistance to downy blight of litchi. During 2012-2016， the system was applied to evaluate the resistance to downy blight among 15 litchi cultivars. The resistance grades of these cultivars were almost the same in different years， and‘Heiyeand‘Guiweiwas the most stable resistant and susceptible cultivars， respectively. These confirmed that the resistance evaluation system of litchi fruit to downy blight was stable.

Key words litchi； Phytophthora litchii； resistance； evaluation system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.022

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）原产于中国南部和越南北部，是中国热带和亚热带地区重要的特色水果[1]。荔枝霜疫霉病（Litchi downy blight）是荔枝的主要病害之一，由荔枝霜疫霉菌（Phytophthora litchii）引起，主要危害果实，从而造成果实腐烂，也危害叶片和花，引起落葉和落花，导致减产30%～80%，且影响果实质量[2-9]。培育抗病品种是解决霜疫霉危害的根本途径。建立准确的抗病性鉴定方法可为获得抗性材料和后续抗性育种提供基础。已有学者建立了柑橘、芒果、苹果、梨、辣椒、大豆等作物的抗病鉴定方法[10-17]，也对荔枝霜疫霉病抗性鉴定方法进行了一些探索[18-20]，但还未形成统一的评价体系。鉴于此，本研究以多个荔枝品种离体成熟果实为试材，研究接种霜疫霉孢子囊浓度、病征记录时间对其抗病分级指标的影响，以期建立稳定的抗病性鉴定体系，为荔枝抗性评价及抗病育种提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 荔枝材料 2012～2016年，先后采摘17个荔枝品种（表1）约八成熟果实，采后2 h内运回实验室，挑选成熟度相对一致、大小基本均一、无病虫害和机械损伤的果实，用自来水冲洗干净，再用无菌去离子水冲洗2遍，自然晾干（约10 min左右）后立即用于接种处理。

1.1.2 霜疫霉菌株 霜疫霉菌株由本实验室从海南永发三月红荔枝果实上分离并保存。于侵染前3周接种至V8固体培养基，28 ℃条件下进行培养。实验前用无菌水浸泡培养皿中的菌丝体，并用小毛刷轻轻刷动以收集霜疫霉菌孢子囊，再用无菌纱布过滤残存的菌丝体。滤液用光学显微镜检测计算孢子囊浓度，按照实验目的配制4×105、4×106、4×107个/mL孢子囊悬浮液，接种时分别稀释100倍。

1.2 方法

1.2.1 果实接种方法 将自然晾干的果实置于稀释好的孢子囊悬浮液中，浸泡5 min后取出，放在底部铺有双层吸水纸的保鲜盒中，喷无菌水至吸水纸润湿，以保持空气湿度。果实单层摆放，相互之间无挤靠。用塑料盖盖紧，于28 ℃放置。每次处理60个果，以每20个果作为1次重复。

1.2.2 发病过程调查 刚接种时以第0小时为准，以后每24 h观察记录1次果实的病情级别（以果实病斑面积占果实总面积的比例表示，表2），直至大部分果实发病为止。

1.2.3 病情指数和抗病性分级 按下式计算病情指数

式中：DI为病情指数，s为各病情级别，n为相应病情级别果数，N为调查总果数，S为最高病情级别代表值室内病情分级及其对应的症状描述。

依据荔枝霜疫霉病的病情指数将荔枝材料的抗病性分为6 级，抗病性评价标准[21]详见表3。

1.2.4 实验过程 2012年，先用‘妃子笑与‘大丁香果实，按照上述方法进行抗性评价，优化确定了处理方法、调查时间、分级阈值等。2012～2016年，分批次评价了其余15个品种的抗性。

1.3 数据分析

本试验所有数据统计分析均采用计算机软件Excel和DPS数据处理系统[22]进行Duncan多重比较。

2 结果与分析

2.1 接种孢子囊浓度的确定

由表4可知，3种孢子囊浓度霜疫霉悬浮液接种‘大丁香和‘妃子笑后，培养24 h时2个品种果实无明显症状，48 h之后出现症状。4×103个/mL孢子囊悬浮液接种‘大丁香在96 h时病情指数才和对照有显著差异（p<0.05），接种‘妃子笑72 h后才表现出显著差异（p<0.05），2个材料的时间不一致，此孢子囊浓度不适合作为抗病性的评价。48 h后一直和对照组表现显著差异（p<0.05）的是4×104个/mL和4×105个/mL两个浓度接种的组合；由于用4×105个/mL孢子囊悬浮液接种，病情发展过于迅速，不利于大量荔枝材料抗病性的评价；而以4×104个/mL孢子囊悬浮液接种，病情发展比较稳定，且和对照组的病情指数呈显著差异（p<0.05），因此，选用4×104个/mL作为接种的孢子囊悬浮液浓度。

2.2 调查时间的确定

以4×104个/mL孢子囊悬浮液接种的2个荔枝材料在24 h未出现明显症状，不适合进行抗性评价；在48 h出现了明显的症状，但病斑直径比较小，病征表现变异系数很大，‘大丁香和‘妃子笑的分别是30.47和32.12，不适合进行抗性评价；在72 h出现明显症状，2个品种各自的症状表现比较稳定，变异系数较小，‘大丁香和‘妃子笑的分别是18.02 和3.62，且2个材料表现出很大的差异，适合进行抗病性的评价；在96 h 病斑直径较大，病情指数均达到90以上，不适合进行抗病性的评价（表4）。综上所述，选4×104个/mL为接种的孢子囊浓度，72 h为接种调查病情指数的时间，以此为荔枝果实对霜疫霉侵染抗性评价体系的最适接种浓度和最佳调查时间。

2.3 部分荔枝品种果实对霜疫霉病抗性的比较

2012～2016年，应用建立的上述评价方法，先后评价了15个荔枝品种对霜疫霉病的抗性，其中，2012～2014年分别评价了15个、7个和13个，2015～2016年对‘黑叶和‘桂味进行了评价（表5和图1）。各品种中，病情指数最低的为21.30（‘四季荔，2012年），最高的为96.30（‘广西勾背，2014年），呈现连续分布趋势。多数品种不同年份之间病情指数较为稳定，如‘四季荔、‘黑叶、‘尚书怀、‘桂味、‘红荔、‘水晶球、‘广西勾背和‘雪怀子。有些品种在不同年份病情级别波动较大，但对抗病/感病的分类总体保持不变，如‘尖叶荔2012年病情指数为73.33，分类为感病，但2014年病情指数升高为93.33，分类为高感，尽管指数变化较大，但同属感病类型。总体上，15个品种表现为抗病的有‘四季荔、‘黑叶和‘尚书怀，感病的有‘挂绿、‘绿荷包、‘桂味、‘怀枝、‘红荔、‘白粉、‘水晶球、‘尖叶荔、‘红绣球、‘广西勾背、‘麻雀春和‘雪怀子。

2012年的数据结果表明，中抗与高感、感病荔枝品种的病情指数差异显著，其他抗性等级之间病情指数差异不显著，或者只有部分差异显著。2013年数据结果表明，中抗与高感、感和中感品種的病情指数差异显著，中感与高感品种的病情指数差异显著，其他抗性等级之间部分差异显著。2014年，感与高感品种病情指数部分差异显著，其他抗性等级之间均差异显著。由于病情指数和抗性等级呈连续分布，所以不同的等级之间也有差异不显著，但在不相邻抗性等级之间荔枝资源的抗性基本都是差异显著。因此，荔枝的抗性如果在相邻抗性等级之间变化，则认为该品种抗性稳定；在不相连抗性等级之间变化的，则认为该品种抗性不稳定。

由图1可知，2012～2016年间评价了不同地区分布的主栽荔枝品种‘黑叶和‘桂味对霜疫霉侵染的抗性，‘黑叶和‘桂味的抗性表现都很稳定：‘黑叶为抗病品种，具体表现为中抗；‘桂味为感病品种，具体表现为中感。

3 讨论

对于建立抗病性鉴定体系，确定孢子囊浓度和接种后调查时间至关重要，但关于荔枝抗病性鉴定体系还未见系统的研究。本研究从‘大丁香和‘妃子笑接种荔枝霜疫霉的结果来分析，荔枝对霜疫霉病抗性评价体系的最适宜接种浓度4×104个/mL，最佳观察时间为72 h。朱若鑫[19]和余中莲[23]观察荔枝的抗病性接种用的孢子囊浓度是1×104个/mL，这与本实验的结果差异不明显。陶挺燕[20]利用4×105个/mL的孢子囊悬浮液，喷雾接种至刺伤荔枝叶片上，这与本实验所用孢子囊的浓度差异很大，可能是针对不同的接种方法和接种材料的原因。

本研究利用该体系对2012～2016年的荔枝材料进行了抗性评价，通过对2012～2014年各年的荔枝资源抗性评价之间的差异性分析，中抗与高感、感之间均属差异显著，由于病情指数和抗性等级呈连续分布，所以会出现相邻等级之间的品种差异不显著的情况。但不相连等级间的差异大部分是显著的。因此，荔枝品种在相邻等级之间抗性变化可认为抗性稳定。3 a间，荔枝资源的抗性基本稳定，也证实了该体系的可靠性。

通过对2012～2014年相同品种的抗病性进行比较，结果发现多个品种的抗病性表现比较稳定，但病情指数都有浮动，部分抗性等级有变化。由于病情指数和抗性程度呈连续分布，如果某一材料的病情指数接近抗性级别的上限或下限，有可能在年度间的重复鉴定中因病害发生程度的小波动而使抗性评价结果出现不一致[24]，但这种变化的幅度可能基本局限在一定的范围内，如高感和感病级别的材料都在感病范围内变化，说明感病种质的抗性具有相对的稳定性[20]。 所以建立这一套体系是非常科学可靠的。其中‘绿荷包和‘挂绿的抗病性鉴定的不稳定因素是2012年的果实成熟度不一致，单果间的发病情况不一致。由于荔枝对荔枝霜疫霉菌的抗性易受环境条件的影响：如打药的频率、施肥量的变化、降雨量的多少和采摘的时机等，这些因素的变化都会影响荔枝材料的抗性评价级别，因此，对初步鉴定为抗病的材料应进行重复鉴定，才能得出正确的结果[20]。

通过对荔枝主栽品种‘黑叶和‘桂味5 a间的抗病性鉴定结果来看，不同地区来源的2个品种利用该体系进行抗性评价结果表现一致：‘黑叶为抗病品种，‘桂味为感病品种。并且各个品种每年的病情指数均差异不显著，证实了该体系的可靠性和稳定性。这可为研究荔枝的抗病性机制提供基础。

参考文献

[1] Vien N V， Benyon F H L， Trung H M， et al. First record of Peronophythora litchii on litchi fruit in Vietnam[J]. Australasian Plant Pathology， 2001， 30（2）： 287-288，

[2] 刘秀娟， 胡美娇. 荔枝果实采后病害和防腐保鲜技术[J]. 热带农业科学， 2000， 20（1）： 67-73.

[3] Wang H C， Zhou M G. Baseline and differential sensitivity of Peronophythora litchii （lychee downy blight） to three carboxylic acid amide fungicides[J]. Plant Pathology， 2009， 58（3）： 571-572.

[4] 戚佩坤. 广东果树真菌病害志[M]. 北京： 中国农业出版社， 2000： 41-42.

[5] 戚佩坤， 潘雪萍， 刘 任. 荔枝霜疫病的研究病原菌的鉴定及其侵染过程[J]. 植物病理学报， 1984， 14（2）： 113-119.

[6] 赖传雅. 农业植物病理学： 华南本[M]. 北京： 科学出版社， 2003： 211-213.

[7] Liu J， Liu A， Chen W. Studies on the biological characteristics of lychee downy blight[J]. Acta Hortic， 2005， 665（52）： 415-420.

[8] Kao C W， Leu L S. Sporangium germination of Peronophythora litchii， the causal of litchi downy blight[J]. Mycologia， 1980， 72（4）： 737-748.

[9] 陈厚彬， 庄丽娟， 黄旭明， 等. 荔枝龙眼产业发展现状与前景[J]. 中国热带农业， 2013， 10（2）： 12-18.

[10] 刘登全， 崔朝宇， 蒋军喜， 等. 不同柑橘品种对黄龙病的抗性鉴定[J]. 江西农业大学学报， 2014， 36（1）： 97-101.

[11] Abe K， Kotoda N， Kato H， et al. Resistance sources to Valsa canker （Valsa ceratosperma） in a germplasm collection of diverse Malus species[J]. Plant Breeding， 2007， 126（3）： 449-453.

[12] Liu H T， Zhang Y J， Li C M， et al. Evaluation of the resistance of malus germplasm to bot canker caused by botryosphaeria dothidea[J]. Journal of Phytopathology， 2011， 159（7-8）： 511-515.

[13] 刘欣颖， 吕 松， 王 忆， 等. 苹果种质资源对苹果树腐烂病抗性评价[J]. 果树学报， 2011， 28（5）： 843-848.

[14] 张美鑫， 霍立峰， 胡红菊， 等. 梨种质资源对腐烂病抗性的室内评价[J]. 园艺学报， 2014， 41（7）： 1 297-1 306.

[15] 杨明英， 曹继芬， 李向东， 等. 辣椒苗期不同生长阶段对疫霉根腐病的抗性研究[J]. 西南农业学报， 2011， 28（1）： 155-158.

[16] 刘 羽， 刘增亮， 高爱平， 等. 芒果种质对炭疽病的抗病性评价[J]. 热带作物学报， 2009， 30（7）： 1 000-1 004.

[17] 李永刚， 文景芝， 郝中娜， 等. 大豆疫霉根腐病抗病性鉴定方法及抗源筛选的研究[J]. 东北农业大学学报， 2008， 39（5）： 1-5.

[18] 范鸿雁， 王祥和， 王家保， 等. 六个荔枝品种对荔枝蝽抗性的初步鉴定[J]. 中国南方果树， 2011， 40（1）： 42-44.

[19] 朱若鑫. 福建主栽荔枝品种的果实对霜疫霉的抗病性及机理初探[D]. 福州： 福建农林大学， 2011.

[20] 陶挺燕. 海南荔枝种质资源对荔枝霜疫霉病抗性鉴定及霜疫霉病防治药效筛选[D]. 海口： 海南大学， 2010.

[21] 陈业渊， 贺军虎. 热带、南亚热帶果树种质资源数据质量控制规范[M]. 北京： 中国农业出版社， 2006： 102-103.

[22] 唐启义. DPS数据处理系统[M]. 北京： 科学出版社， 2010.

[23] 余中莲. 氨基寡糖素诱导荔枝抗荔枝霜疫霉病的抗性[D]. 福州： 福建农林大学， 2011.

[24] 黄天述， 叶华智， 王晓鸣， 等. 玉米种质资源对纹枯病的抗性鉴定与评价[J]. 植物遗传资源学报， 2005， 6（3）： 291-295.