广西境内马褂木天然群体遗传多样性的ISSR分析

李龙梅　石晓蒙　蒋维昕　白天道　蒙奕奕　谭飞燕　黄寿先

摘要： 為弄清广西境内马褂木（Liriodendron chinense）天然群体的遗传多样性及分布情况，该研究运用ISSR分子标记，对广西境内现存的6个野生马褂木种群进行遗传多样性分析及评价。结果表明：广西马褂木群体具有较丰富的遗传多样性，6个参试群体的平均（及总体）有效等位基因数（Ne）、Neis 基因多样度（H）和Shannon信息指数（I）分别为1.454 1（1.633 7）、0.257 6（0.363 3）和0.378 6（0.529 3）；群体间存在基因流动但水平有限（Nm=1.218 4），使群体间存在较高遗传分化（Gst =0.291 0）；聚类分析（UPGMA）将6个天然群体分为东部（全州QZ、资源ZY及融水老堡RSL）、西部（融水安太RSA、环江HJ及乐业LY）两组，其中东部组具有较低遗传多样性及较高的遗传分化，可能受到较强的人为干扰；Mantel检验表明群体间符合距离隔离模式（R=0.545， P=0.043），表明人为破坏导致的生境碎片化是造成广西马褂木天然群体遗传分化的重要原因。针对广西马褂木天然群体较丰富的遗传多样性及较高的遗传分化，除了考虑对遗传多样性较高群体（如RSA及HJ）进行原地保护外，宜对各群体采集种子或穗条，统一营建基因资源收集区，以供后续育种及生产利用。

关键词： 马褂木， 天然种群， ISSR标记， 遗传多样性， 遗传分化

中图分类号： Q943

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）01002207

Abstract： In order to understand the genetic diversity and distribution model of Liriodendron chinense natural population in Guangxi Zhuang Autonomous Region， the genetic diversity and structure of six natural populations were analyzed by using ten ISSR markers. The results showed that there were abundant genetic diversity in six Liriodendron chinense natural populations. The average （or total） effective number of alleles （Ne）， Neis gene diversity （H） and Shannon information index （I） of six populations were 1.454 1 （1.633 7）， 0.257 6 （0.363 3） and 0.378 6 （0.529 3）. A limited gene flow （Nm=1.218 4） resulted in a high genetic differentiation （Gst=0.291 0） among populations. The six populations were divided into two groups depending on cluster analysis （UPGMA method）. One group （west group） contains the populations near the west （RSA， HJ and LY） and the other （east group） included the populations near the east （QZ， ZY and RSL）. The east group had a lower genetic diversity and higher differentiation than the west one， which probably implied that populations in east group were strongly disturbed by human activities. Mantel test （R=0.545， P=0.041） displayed a significant isolation by distance model among populations， which also implied that habitat fragmentation due to human activities was an important factor for a highly genetic differentiation among populations. In the light of abundant genetic diversity and highly genetic differentiation on L. chinense populations in Guangxi， not only in situ conservation for the populations with abundant genetic diversity （e.g. RSA， HJ） is critical， but also ex situ conservation by seeds or cuttings collecting for all populations is also essential for further breeding and propagation.

Key words： Liriodendron chinense， natural population， ISSR marker， genetic diversity， genetic differentiation

马褂木（Liriodendron chinense）系木兰科（Magnoliaceae）鹅掌楸属（Liriodendron）高大乔木，是国家公布的Ⅱ级濒危保护植物（王章荣，2005）。马褂木干形直、生长快，是优良的用材树种；叶形奇特，形似马褂，花大而美，是优良的园林观赏树种（李周歧和王章荣，2000）；也是一个很古老的孑遗树种，对古植物系统学研究具有重要的科研价值（惠利省，2010）。马褂木在我国分布范围较广（22°37′～32°38′ N，103°15′～120°17′ E），分布于11个省区的84个县（郝日明等，1995）。但随着生境变化及人为破坏，其天然分布及群体数量越来越稀少（贺善安和郝日明，1999）。在广西，现有马褂木天然分布區主要位于桂北与黔、湘交界区域，呈片段状分布。作为广西北部重要的树种之一，其天然种群的遗传多样性如何，群体间遗传差异有多大，目前尚不得而知。

ISSR是一种比较理想的分子标记（Reddy et al，2002；王建波，2002；赵谦等，2008）。已被用于许多树种的遗传多样性、种质鉴定、遗传作图、基因定位等研究中（张博，2005；Feyissa et al，2007；汪琼等，2013；林乐静等，2015；刘春英等，2013）。遗传多样性及遗传结构反映了一个物种生存和发展的重要特征。一些学者对中国马褂木种源或野生群体进行了遗传多样性研究，部分研究认为中国马褂木的遗传多样性处于较低水平（惠利省，2010；占志勇，2010），但亦有研究认为其具有较高的遗传多样性（Li et al，2014）。但在遗传分化上均一致认为群体间分化较大，彼此基因交流较少，认为马褂木天然群体生境已严重碎片化（李建民和周志春，2002；惠利省，2010；Li et al，2014）。以往研究主要从大尺度上（全国范围）对马褂木的遗传多样性及遗传结构进行了研究，采样地点涉及全国诸多省区。但对广西区内天然马褂木群体的分布现状及遗传多样性水平鲜有涉及，仅少数文献在研究中涉及到了广西资源猫儿山群体（朱晓琴等，1997；Li et al，2014）。

虽然这些研究从整体上对中国马褂木的分布格局和遗传资源的保护和利用提供了非常有价值的信息，但对局部范围内马褂木天然种群进行遗传多样性及区域遗传结构研究可以更清楚地揭示小尺度水平上马褂木遗传多样性水平及变化规律，剖析其产生原因，进而为该地区天然马褂木遗传资源的合理保存和利用提供理论依据。同时也作为马褂木大尺度研究的有效补充，完善中国马褂木遗传资源的保存策略。基于此，本研究利用ISSR分子标记，分析了广西境内马褂木天然群体的遗传多样性及遗传结构，力求为广西现有马褂木天然群体的合理保存、收集与利用提供参考。

1材料与方法

1.1 研究材料及采样策略

研究材料为广西境内的6个马褂木野生群体（表1），采样地分别位于广西全州安和（QZ）、资源两水（ZY）、融水老堡（RSL）及安太（RSA）、环江明伦（HJ）及乐业雅长（LY） 6个乡镇。

采样策略为每个群体随机挑选30个植株，尽量保证群体内采样株间距在30 m以上（其中LY群体由于株数太少（9株）而对群体内所有植株进行了采集），样本共计159个。分别采集3～5片嫩叶装入塑料自封袋，编号后置于冰盒中，带回实验室备用。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取与检测马褂木叶片总DNA采用试剂盒（杭州博日）提取。然后取5 μL DNA样品，利用1% 琼脂糖凝胶进行电泳检测（DYY12型高压电泳仪，北京六一）。利用NanoDrop ND1000（Themo scientific，美国）检测DNA的浓度与纯度，并根据测定结果将浓度稀释至60 ng·μL1。

1.2.2 ISSR引物筛选ISSR引物源于加拿大不列颠哥伦比亚大学（University of British Columbia）公布的序列（Set No.9， No.801900）。经引物合成（上海捷瑞）、筛选，选取了扩增条带清晰、稳定的10条引物作为标记引物（表2），进行群体检测。

1.2.3 ISSRPCR扩增条件与检测ISSRPCR扩增体系：总体积20 μL，其中含10×buffer为2.0 μL、MgCl2浓度为1.8 mmol·L1、dNTPs终浓度为0.2 mmol·L1、引物终浓度为0.5 μmol·L1、 Taq DNA 聚合酶1 U、DNA模板60 ng。于Biometra TGradient 96 PCR仪（德国）上进行扩增，扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50～56 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，45个循环，72 ℃完全延伸7 min，4 ℃保存（石晓蒙等，2013）。PCR产物检测：取8 μL PCR产物，用水平电泳分离条带（1%琼脂糖凝胶）。电压100 v，电泳时间1 h ，以100 bp ladder DNA为参照。电泳完成进行凝胶成像（Biosens SC750凝胶成像系统）（其中，10×buffer、dNTPs、Taq DNA 聚合酶均购自捷瑞生物工程有限公司。）

1.2.4 数据分析能清晰扩增的位点进行记录（有条带记为1，无条带记为0，构建各群体的0、1矩阵）。利用POPGENE1.32（Yeh et al，1999）计算群体遗传多样性指标，包括有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样度（H）、Shannon信息指数（I）及多态位点百分率（PPB）等、群体间Neis遗传距离（D）及基因分化系数（Gst）；利用GenAlEx 6.5进行Mantel 检验（Peakall & Smouse，2012）；利用MEGA 5绘制系统聚类图（UPGMA法）（Tamura et al，2011）。

2结果与分析

2.1 参试ISSR标记扩增多态性分析

对ZY、QZ、RSA、RSL、HJ及LY共6个自然群体进行ISSRPCR扩增，结果显示：每个标记在参试群体中扩增出的条带数不等，在10～16条之间（平均12.5条）。10个标记的多态位点百分率（PPB）在92.86%～100%之间（平均97.95%）；扩增位点的片段大小在200～2 200 bp之间；其中扩增位点最多的为UBC881（16个），最少为UBC889及UBC890 （10个）（表2，图1）。

2.2 群体遗传多样性分析

总体来看，6个参试群体的有效等位基因数（Ne）、Neis基因多样度（H）、Shannon信息指数（I）及多态位点百分率（PPB）分别在1.383～1.546、0.213～0.309、0.312～0.455及57.6～81.6之間。RSA群体在参试群体中遗传多样性水平相对最高（N=1.546，H=0.309，I=0.455，PPB=81.6），而RSL群体各遗传多样性指标均最低（N=1.383，H=0.213，I=0.312，PPB=57.6）， 6个群体中有3个群体（ZY、 RSL、LY）的遗传多样性指标均低于平均值（表3）。

2.3 群体遗传分化分析

经过计算，发现有29.1%的遗传变异发生在6个群体间（Gst=0.291）（表4），而种群内遗传变异为70.9 %；AMOVA分析亦获得类似结果，6个参试群体间的遗传变异约为31.5%（ФST=0.315）。这接近于以往马褂木大尺度水平上的研究结果（李建民等，2002；惠利省，2010）。群体间的基因流Nm为1.218，稍高于Wright（1931）提出的可以有效阻止因遗传漂变而引起的群体间遗传分化的临界值（Nm>1）。说明参试种群间虽存在基因交流，但群体间在遗传上仍然有不小的分化，这意味着该基因流水平未能有效阻止参试群体间在遗传上的分化。

2.4 群体的遗传距离及聚类分析

6个马褂木野生群体的遗传距离的变化在0.101 4～0.232 8之间（平均0.1742） （表5）。其中LY群体与其他几个群体的遗传差异相对较大。基于群体间遗传距离，构建了6个马褂木自然群体的亲缘关系图（图2）。6个群体主要分为两大类，一类是由处于东部的QZ、RSL及ZY群体构成；另一类由靠近西部的HJ、RSA及LY群体组成。总体上距离较近的群体聚为一类。

Mantel检验表明参试群体间在遗传距离和地理距离上存在显著的正相关性（R=0.545，P=0.043）（图3），遗传距离随地理距离的增大而增大，说明地理隔离是导致群体间遗传分化的原因之一。

3讨论与结论

3.1 广西现存马褂木自然群体的遗传多样性

该研究利用ISSR标记对广西境内现存的6个马褂木自然群体的遗传多样性进行了分析，结果表明，广西现存马褂木自然群体具有较丰富的遗传多样性。广西马褂木天然群体平均Neis基因多样度（H）为0.257 6，总H为0.358 9。与前人研究利用等位酶（0.265 0）（朱晓琴等，1997）、RAPD（0.256 8）（李建民等，2002）及SRAP（0.252 1）（赵亚琦等，2014）标记研究的马褂木天然群体（或种源试验林）的多样性水平相当。与其他树种比较，广西马褂木ISSR遗传多样性高于银杏（Ginkgo biloba）（葛永奇等，2003）、枫香（Liquidambar formosana）（毕泉鑫等，2010）、锥栗（Castanea henryi）（龚榜初和刘国彬，2013）等树种。在群体规模较小、其生境碎片化情况下，各群体仍能维持较高的遗传多样性，这一方面很可能与马褂木高度异交的繁殖策略有关（Li et al，2014），另一方面，有效种群大小小于20个，不存在选择和基因流时，遗传漂变和近交对群体遗传变异大小的影响才会凸显（陈小勇，2000）。而本研究中，除LY群体外，其他群体大小均在30个以上，且大多为成年树，同时群体间或多或少存在一定程度的基因流动（Nm=1.218 4），因此，群体的遗传多样性水平能够在一定程度上得以维持。

3.2 广西马褂木自然群体的遗传分化及原因

与其他从大尺度（全国范围）上研究马褂木遗传分化的结果类似（惠利省，2010），广西马褂木天然群体间存在较高的遗传分化（Gst=0.291 0）。虽然群体间基因流动（Nm=1.218 4）稍高于大尺度水平上的研究结果（朱晓琴等，1997；惠利省，2010；Li et al，2014），但与其他一些遗传分化较低的树种比较，该基因流水平仍然偏低（郎萍和黄宏文，1999；徐小林等，2005；毕泉鑫等，2010），不能有效阻止群体间的分化。Mantel 检验（R=0.545，p=0.041）表明，群体间符合距离隔离模式，群体间分化程度大小与地理距离大小呈显著正相关。这与以往马褂木自然群体的研究结果一致（惠利省，2010；Li et al，2014）。马褂木作为虫媒植物（王章荣，1997），昆虫对花粉传播能力会显著受到地理隔离的影响。

需要指出的是，尽管6个参试群体总体上符合距离隔离模式，但群体间现有的遗传结构显然还受到其他一些因素的影响。从遗传距离聚类结果可知（图3），群体间的遗传距离大小与地理距离变化并不完全一致，从组间来看，RSA和RSL群体间的地理距离并不大，却各自聚类到不同组中。主要原因可能是两个群体受到的人为影响不同，RSL群体相对更靠近人类聚居区，受到的人为干扰和破坏更大。两个群体截然不同的遗传多样性水平（RSL各项指标均最小）也侧面证实了这一点；此外，另一可能原因是位于两个采样群体间的元宝山对传粉媒介起到了一定的阻隔作用，降低了基因流。从两个组的遗传多样性及聚类图可知，西部组群体具有相对较高的遗传多样性（其中LY群体因规模较小除外，可能近年几十年来遭受较大强度的采伐破坏），群体间遗传距离较小，据此可以推测，东部组群体演化过程受到人为干扰要远大于西部组。这可能归因于东部组群体位于桂东北交通要道，人为活动频繁，使群体规模剧减，群体间分化加大。

3.3 广西现有马褂木自然资源的收集与保存

在国内野生马褂木资源日渐稀少，遗传多样性急剧下降情况下，广西境内现有马褂木野生群体仍具有较高的遗传多样性，这使得广西现有马褂木资源的保护、收集和保存具有重要意义。尤其对于遗传多样性较高的RSA及HJ群体，应加强其现有栖息地的保护，减少人为破坏，通过结合自然保护区或生态防护林的方式，对其进行就地保存。同时，针对广西马褂木群体间较高的遗传分化现状，应考虑对各群体采集种子及穗条等，采用有性及无性繁殖方式，摸索适宜的配套繁育措施，在合适区域统一营建基因保存林，并结合种源试验，筛选出优良种源及个体，在后续育种及生产中加以利用。

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