广西特有珍稀濒危植物小花异裂菊遗传多样性分析

史艳财　唐健民　柴胜丰　邹蓉　陈宗游　韦霄

摘要： 采用ISSR分子標记技术，对广西特有珍稀濒危植物小花异裂菊6个野生种群的遗传多样性进行了研究。结果表明：10条引物对141个个体共检测到96个位点，其中29个位点具有多态性，多态位点百分率（PPB）为30.21%。在物种水平上，小花异裂菊PPB为30.21%，Neis基因多样性指数（H）为0.105 4，Shannons信息指数（I）为0.154 6。在种群水平上，PPB为9%～19%，H为0.021 2～0.051 3，I为0.033 9～0.080 5。基于Neis遗传多样性分析所得出的种群间基因分化系数Gst=0.690 5，表明种群内的遗传变异为30.95%，种群间的遗传变异为69.05%，小花异裂菊的遗传变异主要存在于种群间。AMOVA分析结果与前面结果相符。小花异裂菊种群间的基因流（Nm）为0.224 2。从遗传距离看，杨堤和兴坪种群的遗传距离最小，为0.039 8，白沙和阳朔之间的遗传距离最大，为0.160 9。在UPGMA聚类图中，6个种群可分为两组，阳朔和高田为一组，普益、白沙、兴坪、杨堤聚为一组。研究认为小花异裂菊的自交亲和的繁育系统和分布区域的片段化可能是导致种群遗传多样性较低和种群间高遗传分化的主要原因。该研究结果为该物种种质资源的保护提供了科学依据。

关键词： 小花异裂菊， ISSR， 遗传多样性， 遗传分化

中图分类号： Q311

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）01000906

Abstract： Heteroplexis microcephala is an endangered plant only found in karst limestone regions in the Yangshuo County of Guangxi Zhuang Autonomous Region in China. In the present study， ISSR markers were used to evaluate the genetic variation within and among wild populations that were sampled from Guangxi with a goal to collect basic genetic information for its conservation. Leaf samples of 141 individuals were collected from six counties. Based on 10 ISSR primers， 96 clear and reproducible DNA fragments were generated. The percentage of polymorphic bands （PPB） was 30.21%， Neis gene diversity （H） was 0.105 4， Shannon information index （I） was 0.154 6 at the species level， and PPB among population ranged from 9% to 19%， H ranged from 0.021 2 to 0.051 3， I ranged from 0.033 9 to 0.080 5. High levels of genetic differentiation among the populations （Gst=0.690 5） were detected on the basis of results from POPGENE， which indicated that 69.05% of the genetic variability was distributed among populations， and only 30.95% of the variation existed within populations. Molecular variance was also examined using AMOVA based on RAPD banding patterns. The variance component found within populations was 27.28%， and a variance of 72.72% was found among populations. Gene flow（Nm） among the population was 0.224 2 indicating that there was a low migration rate between populations. The highest genetic distance based on Neis genetic genetic distance for all population pairs was 0.160 9 between populations BS and YS， while the lowest was 0.039 8 between XP and YD. UPGMA analysis was performed based on genetic similarity （Jaccard coefficient）. Six populations were clustered into two main groups， one containing populations YS and GT， and the other containing PY， BS， XP and YD. The high genetic variance among populations and the low genetic diversity within population could be attributed to the breeding system of part selfcompatibility and the limited gene flow among populations of H. microcephala.

Key words： Heteroplexis microcephala， ISSR， genetic diversity， genetic relationship

异裂菊属（Heteroplex Chang）为广西稀有的特有属，1937年作为一个单种属发表（陈艺林，1985）。该属5个种全部为中国特有种：异裂菊（H. svernonioides）、小花异裂菊（H. microcephala）、绢叶异裂菊（H. sericophylla）、凹脉异裂菊（H. impressinervia）和柳州异裂菊（H. incana）（陈艺林，1985；梁健英，1994；覃海宁和刘演，2010）。小花异裂菊地理分布范围十分狭小，仅分布于广西阳朔县石灰岩石山山顶的狭小区域，种群个体数量很少。近年来，由于自然生态环境和植被遭受破坏，该种的野生植株正在逐年减少。小花异裂菊对于研究菊科某些类群的分类及其演化具有重要的科学价值，已被列为国家二级保护植物（付立国，1992）。

小花异裂菊一般不能形成大的群落，只分布在石山上部的小片区域，形成局部片段群落，这种片段化分布极有可能会对小花异裂菊的遗传多样性及其进化潜能造成影响。近年来，小花异裂菊的研究只有核型（张国莉和龚洵，2002）、化学成分（樊晓娜等，2010）、异地保护适应性（黄仕训等，2002）、ISSR分析条件优化（史艳财等，2012）等少数几个方面，对于其分子水平的研究尚未见报道。通过物种的遗传多样性及其遗传结构的分析可以加深对该植物进化历史和适应机制的认识，并可为该植物的保护提供科学的指导。对于不同群落类型小花异裂菊种群的遗传多样性变化规律的研究将可深入了解其适应进化及其濒危机制。ISSR集SSR和RAPD技术的优点于一身，实验操作快速、简单，费用低，可检测到的遗传多态性高，是Zietkiewicz & Rafalskia （1994）提出的一种分子标记技术。目前，ISSR已广泛应用于植物系统演化、分类以及遗传多样性等研究（莫文娟等，2013）。本文采用ISSR技术从DNA水平分析了小花异裂菊种群的遗传多样性和遗传结构，以阐明小花异裂菊对环境的适应机制及其进化潜力，为有效保护小花异裂菊的遗传资源提供科学依据。

1材料与方法

1.1 供试材料

2012年在广西桂林市阳朔县选择6个小花异裂菊种群采集样品，每个种群采集15～40个生长健壮、无病虫害植株的幼嫩叶片，植株之间至少间隔5 m。选取每个植株嫩叶3～5片，装于放有硅胶的封口袋中干燥保存（柴胜丰等，2014）。6个种群的地理位置分布见表1。

1.2 基因组DNA提取与聚合酶链式反应（PCR）扩增

植物总DNA采用改良后的CTAB法提取。用1%琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度计分别检验DNA质量和浓度，置于-20 ℃冰箱中保存。ISSRPCR反应体系为25 μL的体系中含dNTP 0.20 mmol·L1，Mg2+ 1.5 mmol·L1， TaqDNA聚合酶1.5 U，模板DNA 50 ng， 引物0.8 μmol·L1， 10×Buffer 2.5 μL。最后确定的PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；40个循环；94 ℃变性40 s；53 ℃退火45 s；72 ℃延伸1.5 min；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。取5 μL PCR扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳1～2 h，然后用0.5 μg·mL1 的EB液染色20 min， 置于UVP凝胶成像系统中拍照。

1.3 引物筛选

扩增引物采用加拿大哥伦比亚大学（UBC）公布的第9套100条ISSR引物序列，序列在上海生物工程公司合成。从6个种群中各选取1个个体进行引物扩增筛选。用10条扩增条带清楚、重复性好的引物（表2）用于所有个体的扩增。

1.4 数据处理与统计分析

按照电泳图谱中同一位置上DNA条带有或无赋值，无带（隐性）记为“0”有带（显性）记为“1”。多态位点百分率（PPB）、有效等位基因数（Ne）、观测等位基因数（Na）、Shannons信息指数（I）、Neis基因多样性（H）群体总基因多样性（Ht）、各群體之间的遗传分化指数（Gst）和Neis遗传距离利用POPGENE 3.2软件和NTSYSpc2.1软件计算（张杰等，2012）。

采用DCFA1.1软件计算欧式距离平方和，用WINAMOVA1.55软件进行分子方差分析，计算种群内、种群间的变异方差分布。小花异裂菊种群间的遗传关系聚类分析基于Neis遗传距离，利用NTSYS pc2.1软件的非加权配对算数平均法（UPGMA）计算（卜静等，2012）。

2结果与分析

2.1 小花异裂菊的遗传多样性

10条引物对小花异裂菊6个种群141个个体共扩增出96条条带，其中29条多态带，多态位点比率为（PPB）30.91%。10条引物扩增总带数1～10不等，平均扩增带数为2.9。在物种水平上，小花异裂菊PPB为30.21%，Neis基因多样性（H）为0.105 4，Shannons信息指数（I）为0.154 6；在种群上平上，PPB的变化范围为9～19%，平均为13.33%，H的变化范围为0.021 2～0.051 3，平均为0.032 5；I变化范围为0.033 9～0.080 5，平均为0.052 2。观测等位基因数为1.090 0～1.190 0，有效等位基因数为1.034 1～1.082 3。种群YS的多态位点百分率、等位基因数、观测等位基因数、有效Neis基因多样性以及Shannons信息指数均高于其他种群，BS种群最低。

2.2 小花异裂菊种群的遗传结构

小花异裂菊总的基因多样性（Ht）为0.105 0，种群内基因多样性（Hs）为0.032 5，种群间的基因多样性（Dst）为0.072 5，基因分化系数（Gst）为0.690 5，总的遗传变异中有69.05%来自于种群间，种群内的遗传变异占30.95%，说明小花异裂菊的遗传变异主要来自于种群间。AMOVA分析结果与前面结果相符，在总的遗传变异中，27.28%的变异发生在种群内，72.72%的变异发生在种群间，说明遗传变异主要发生在种群间。小花种群间的基因流（Nm）为0.224 2。

2.3 小花异裂菊种群间的遗传一致度和遗传距离

从遗传距离看，YD和XP的遗传距離最小，为0.039 8，BS和YS之间的遗传距离最大，为0.160 9。从遗传一致度看，YD和XP的遗传一致度最高，为0.961 0，BS和YS的遗传一致度最低，为0.851 4，两者表现规律基本一致。在UPGMA聚类图中，6个种群可分为两组，YS和GT为一组，PY、BS、XP、YD聚为一组。

3讨论

3.1 小花异裂菊的遗传多样性

许多研究结果证明稀有、特有或分布区很狭窄的物种其遗传多样性水平都相应偏低（李昂和葛颂，2002），但也有些却能保持较高水平的遗传多样性（Richter et al，1994）。采用ISSR技术得到的小花异裂菊6个野生种群物种水平的PPB、H、I的值分别为30.21%、0.105 4、0.154 6，小花异裂菊种群内的遗传多样性PPB=13.33%，Hs=0.032 5，H=0.032 5，I=0.052 2，种群间遗传分化程度Gst=0.690 5，多样性指数均较低，低于种子风媒植物（Hs=0.261，Gst=0.23）、异花传粉植物（Hs=0.260，Gst=0.23）和长命植物（Hs=0.242，Gst =0.23）的平均水平（Ge et al， 2003）以及Nybom & Bartishji（2000）基于RAPD、AFLP、ISSR等显性标记所统计的107个物种总结得出的平均遗传多样性（PPB=71.02%），表明其种群水平和物种水平上遗传多样性都较低。以往研究结果表明，繁育系统、分布范围、生活型、分类地位、种子散播机制在种群水平上对遗传变异的影响呈下降趋势（Hamrick et al， 1989），繁育系统可同时影响种群和物种水平上的遗传变异。一般来说，分布范围广、寿命长、风媒授粉、异交为主、结实性高且存在于演替末期群落中的物种具有较高的遗传变异（Korron， 1987）。小花异裂菊分布在广西阳朔县，其分布范围的地理跨度较小，主要分布于石灰岩石山上部向阳的狭小范围内，无论是光照、湿度、温度、土壤量等都相差不大，造成各局域生境因子的较小差异。此外，小花异裂菊的繁育系统为异交、部分自交亲和在长期进化过程自交程度随着种群的减小而呈加剧趋势。因此，生境片段化和自交繁育系统可能是使得小花异裂菊在物种水平上具有较低水平的遗传多样性的主要原因。

3.2 小花异裂菊种群的遗传分化

小花异裂菊种群间基因分化系数Gst为0.690 5，总的遗传变异中有69.05%来自于种群间，表明种群间发生了较大程度的遗传分化。Wright （1965）提出可根据种群每代迁移数（Nm）的大小来判断种群间遗传分化的主要原因。根据基因流估算值的大小，分为高、中、低三个水平（Govindardju et al， 1988）。种群间的基因分化与基因流Nm的数值呈负相关，大的基因流可以阻止种群之间的遗传分化。小花异裂6个种群的基因流仅为0.224 2，远小于1，基因流呈低水平。

一般来说木本植物基因流的大小主要决定于花粉流或种子流（Ennos，1994）。据观测，小花异裂菊的繁育系统为异交、部分自交亲和、需传粉者。小花异裂菊开花期山顶温度可以高达40 ℃左右且持续时间长，光照强烈，白天和夜晚的风速都相对较高。在强风和高温作用下柱头表面干燥和花蜜蒸发速度加快，花粉对传粉者的吸引力降低，使传粉者的活动减少。气象因素的变化还会影响访花者的种类和数量。这些因素使小花异裂菊具有不稳定的传粉环境。小花异裂菊各种群呈片段化分布，花粉难以通过风媒或传粉者在水平地理、垂直距离都较远的种群间进行有效的传播，不同种群间相互传粉受精几率愈来愈小，不利于种群之间、分布区域之间的基因交流。小花异裂菊种群的植株数量一般在10～50之间，其中只有部分开花，昆虫随机的访花方式极易引起同株异花授粉，从而导致自交。小花异裂菊自然分布十分狭窄，种群规模很小，长期的自交在一定程度上导致种群遗传多样性降低。

野外调查发现小花异裂菊虽然结实率很高，但种子萌发率极低。其次小花异裂菊幼苗分布地多位于植被的底层，光照度低，弱光导致幼苗生长异常，生存能力降低，种群的自然更新能力较差。以上因素造成小花异裂菊种群个体数量日益缩小。50个个体为维持足够等位基因丰度的最小有效种群的个体数， 500个个体才能保证维持种群内数量性状的遗传变异和种群对不断变化的环境的适应能力。我们在野外调查发现，小花异裂菊绝大多数种群中的个体在3～100之间，远远低于可维持种群遗传多样性的有效规模。种群个体数量的不断减小必然导致小花异裂菊遗传多样性的丧失（Franke et al， 1995）。

一般来说，植物的多样性中心可能是该物种的起源中心（Vavilov，1930），因此YS种群可能是小花异裂菊的部分起源中心。YS位于6个种群的中间位置，与其他种群有相对较大的基因流交流，基因重组的空间和机会更大，更易扩大种群的遗传多样性水平。UPGMA聚类结果显示，YS和GT，BS和YD，XP和PY亲缘关系相对较近，来自于相近地理生态型的种群可以聚于一类，呈现出一定的地域性分布规律。这可能是产期自然选择使个体中发生的不定向变异演变为群体遗传结构的定向变异（张怀山等，2014），再加上长期的自交等因素，导致同一地区的大部分个体基因型趋于相似的结果。

3.3 保护措施

建议采取以下措施对小花异裂菊资源进行保护：（1）制止乱砍滥伐，保护的生境不被破坏。（2）提高基因杂合度。小花异裂菊受威胁最主要的内在因素是其有性繁殖能力低，种群复壮最主要的途径就是提高有性繁殖能力。因此，保存现有小花异裂菊种群面积或者人工促进种群内与种群间的传粉，增加后代的基因杂合度，可在很大程度上达到复壮种群的目的。（3）小花异裂菊种子萌发率和幼苗成活率都极低，在以后的研究中需加强对小花异裂菊种子育苗和管理技术的研究。

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