抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因克隆及其结构分析

马兰　刘爱平　王佳　王小红

摘要：[目的]克隆构建黄曲霉毒素B1（AFB1）单链抗体（scFv）基因，并对其编码蛋白序列和结构进行分析预测，为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据。[方法]以抗AFBl单克隆抗体杂交瘤细胞株为原料，通过PCR扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），以（Gly₄Ser），为柔性接头（Linker）拼接构建抗AFBlscFv基因，并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测。[结果]抗AFBlscFv基因全长744bp，编码248个氨基酸，分子量为26312.05Da，理论等电点（pI）5.70，其二级结构中含有35个α-螺旋（占14.11%）、28个β-折叠（占11.29%）、85个延伸链（占34.28%）和100个随机卷曲（占40.32%），在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近，形成典型的抗体结构——沟槽结构，是scFv的抗原结合区域。[结论]构建的抗AFBlscFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸，具备典型抗体结构——沟槽结构，能与抗原特异性结合。

关键词：黄曲霉毒素B1（AFB1）；单链抗体（scFv）；重链可变区（vH）；轻链可变区（VL）；沟槽结构

中图分类号：S859.87 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2064-07

0引言

[研究意义]黄曲霉毒素（Anatoxins，AFTs）是由黄曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（A.parasiti-CUS）等真菌产生的有毒次级代谢产物，至今共发现20多种黄曲霉毒素及其衍生物（Delmulleeta1.，2005；李鑫等，2012a），其中以黄曲霉毒素B1（AFBl）的毒性最强，已被世界卫生组织癌症研究机构列为I类致癌物质（庄振宏等，2011）。由于AFB1污染食品及其原料范围广，对人类健康具有极大危害，因此非常有必要针对其建立一种准确、快速的检测方法。根据AFBl溶解性、光谱学特性等建立的检测方法有薄层色谱法、气相色谱分析法、高效液相色谱分析法等，虽然检测灵敏度和准确性高，但检测成本高、前处理复杂，不适用于大批量样品阳性筛查。免疫分析法是基于抗原抗体特异性反应对AFB1进行定性和定量分析，具有方便、快速、成本低、特异性高等优点（孙清，2016）。抗体作为免疫分析的核心试剂，经历了多克隆抗体、单克隆抗体到基因工程抗体的发展。单链抗体（Singlechainantibodvfragment，scFv）是一类典型的基因工程抗体，由一段多肽链（Linker）将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）连接而成（Hustoneta1.，1988），具有生产周期短、批次问差异小、可基因修饰等优点，尤其在AFB1等小分子污染物检测中具有广阔的应用前景。[前人研究进展]scFv分子量为26-28kD，是传统抗体的1/5，但仍保持与待测物结合的特异性和检测灵敏性，是生物毒素检测领域最常用的基因工程抗体（Bazineta1.，2017）。在原核表达系统中，scFv制备一般有两种途径（Lieta1.，2013）：一种是基于噬菌体展示技术，从脾细胞中提取并扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），构建噬菌体展示单链抗体文库，通过“吸附-洗脱-扩增”过程从中筛选出与AFBl亲和力强的scFv（Edupugantieta1.，2013；Wangeta1.，2016；徐重新等，2017）；另一种途径是通过提取阳性单克隆杂交瘤细胞的RNA，体外将VH和VL连接，无需借助噬菌体展示体系，可避免展示文库构建和筛选等繁琐的步骤，但此法会降低scFv与目标物的亲和力，一般比单克隆抗体低10-100倍（Hueta1.，2015）。孙宪连（2006）首次应用噬菌体展示技术成功制备获得抗AFBlscFv；李鑫等（2012b）从单克隆细胞株8F6中克隆得到抗AFB1scFv，实现了scFv在大肠杆菌中的表达，并建立了间接竞争免疫分析方法，对AFBl的半抑制率（IC50）为0.57ng/mL；Li等（2013）通过提取20多株抗AFBl单克隆抗體阳性杂交瘤细胞的总RNA，构建了抗AFB1scFv文库，库容为3.5×10₅CFU。此外，scFv也可在真核表达系统中表达。王婷等（2017）通过扩增抗AFBlscFv基因，将其转入毕赤酵母表达系统，用0.8%甲醇可诱导scFv发生可溶性表达。scFv的另一个优势是其基因序列已知，通过对其蛋白结构的预测和分析可精确定位抗原抗体的结合位点（Hueta1.，2016），为体外改造和促进抗原抗体亲和力提供技术支持。Min等（2015）从酵母突变文库中筛选获得抗AFBlscFv，分析该抗体氨基酸序列，结果发现其突变子通过变构效应与AFB1形成一个结合区域，从而提高抗体亲和力。[本研究切入点]为提高scFv的应用价值，当前研究主要通过构建或扩大抗体文库等方式筛选出合适的scFv，但针对抗AFB1scFv重组构建及其性质分析的研究鲜见报道。[拟解决的关键问题]以AFBl为研究对象，扩增抗AFB1抗体的VH和VL基因，通过柔性接头将二者拼接以构建抗AFB1scFv，并对其理化性质和蛋白结构进行分析预测，为scFv分子修饰改造及在免疫学检测中的应用提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

抗AFBl单克隆抗体杂交瘤细胞株由华中农业大学食品生物技术与安全实验室构建提供；T100^TMThermalCyclerPCR仪、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶成像系统分析仪购自美国Bio-Rad公司；58IOR冷冻高速离心机购自德国Eppendorf公司；DNA聚合酶、限制性内切酶NcoI和BamHI及大肠杆菌DH5a感受态细胞购自美国NewEnglandBiolab公司；RevertAidTMcDNA单链合成试剂盒购自美国Roche公司；其他相关试剂均为国产分析纯。

1.2抗AFBl单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA提取

从液氮罐中取出冻存的抗AFBl单克隆抗体杂交瘤细胞株，迅速放入37℃水浴锅中解冻后置于完全培养液中复苏。收集处于对数生长期的细胞，加入1.0mLTrizol试剂混合均匀，室温下静置5min后加入200.0μL三氯甲烷，混匀后静置10min，12000r/min离心15min，将含有RNA的上清液转移至无菌离心管中，再加入等体积异丙醇，静置10min沉淀RNA，12000r/min离心20min，弃上清液，加入75%乙醇洗涤沉淀两次，离心后加/k50.0μL经DEPC处理的无菌水溶解RNA，取少量RNA测定其浓度和纯度，剩余RNA于80℃保存备用。

1.3cDNA第一链合成

以RNA为模板，反转录合成cDNA：取5.0μLRNA，加入5.0μL5×缓冲液、2.0μLdNTP（2.5mmol/L）、1.0μLOligo（dT）Primer（50μmol/L）、2.0μLRNase抑制剂和0.5μL逆转录酶（200U/μL）。反转录程序：25℃10min，42℃1h，70℃15min。合成的cDNA于-80℃保存备用。

1.4VH和VL基因扩增

以cDNA为模板PCR扩增抗体可变区VH和VL基因，参照Zhou等（1994）的方法设计引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系25.0μL：1.5μLcDNA模板，2.5μL10×缓冲液，1.0μLdNTP（2.5mmol/L），1.0μL正、反向引物（10gmol/L），0.2gLDNA聚合酶，无菌纯水补足至25.0μL。扩增程序：94℃预变性4min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行25个循环；72℃延伸7min。采用1.0%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以QIAquickGelExtractionKit试剂盒回收纯化PCR产物（VH和VL基因片段）。

1.5抗AFBlscFv基因构建

利用重叠延伸PCR（sOE-PCR）构建VH-linker-VL顺序的scFv基因，连接肽为（Glv4Ser）₃。以1.0μLVH基因片段为模板，引物采用VH-linker-For和VH-linker-Back（表1），加入2.5μL10×PCR缓冲液、1.0μLdNTP（2.5mmol/L）和DNA聚合酶，无菌纯水补足至25.0μL，扩增VH-linker基因片段；扩增程序与1.4一致。同理采用VL-linker-For和VL-linker-Back扩增VL-linker基因片段。以VH-linker和VL-linker各1.0μL互为模板，VH-linker-For和VL-linker-Back为引物（表1），扩增scFv基因；扩增程序与1.4一致，采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

1.6抗AFBlscFv重组质粒构建

用限制性内切酶NcoI和BamH1分别酶切scFv基因和pET-3d载体，酶切产物以0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，按QIAquickGelExtractionKit說明回收目的条带，然后连接回收的酶切产物，连接反应体系：30ng基因片段，30ng载体质粒，0.5μLT4DNA连接酶，1.0μLT4DNA连接酶缓冲液，16℃过夜连接。连接产物转化DH5a感受态细胞。挑取LB培养基上的单克隆，提取质粒，阳性重组质粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.7scFv基因序列比对分析

根据scFv基因序列，采用Bioedit翻译成氨基酸，并将翻译结果输入Igmt/v-Quest（http：//www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest）中，对scFv的框架区（FR）和超变区（cDR）进行划分。同时，在NCBI数据库中对其碱基序列和氨基酸序列进行比对分析，明确与其他抗体蛋白的同源性。

1.8scFv蛋白结构预测

根据scFv氨基酸序列，采用ExPASyProteomicsTools中的ProtParam程序（http：//web.expasy，org/prot-param/）计算其蛋白分子量、等电点等参数（Bazineta1.，2017），并以NPS@SOPMA程序（https：//npsa-pra-bi.ibcp.fr/cgi-bin/npsaautomat.pl？page=npsasopma.html）预测该抗体蛋白二级结构。在SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）中输入scFv氨基酸序列，通过序列比对找到与目标蛋白相似性较高且具有已知结构的序列，推测scFv蛋白的三级结构。

2结果与分析

2.1scFv可变区基因的扩增结果

提取获得的抗AFB1单克隆抗体杂交瘤细胞株总RNA在凝胶成像系统中可观察到3条明显的条带，分别为28SRNA、15SRNA和5SRNA（图1）。以RNA为模板，反转录合成cDNA后扩增VH和VL基因片段，结果均扩增得到单一的特异性条带，两个片段大小约350bp（图2），与预期结果相符。

2.2scFv基因构建及序列鉴定结果

回收VH和VL基因片段，以SOE-PCR构建VH-linker-VL顺序的scFv基因，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测得到大小约750bp的目的条带（图3），与预期结果相符。将scFv基因连接至pET-3d载体构建获得的DET-3d-scFv重组质粒经NcoI和BamHI双酶切鉴定，结果获得两条清晰的目的条带（图4），其大小分别为4600和750bp。以pET-3d通用引物测定双酶切获得的scFv基因序列，结果表明，scFv基因片段大小为744bp，其中VH片段为351bp、VL片段为348bp。

2.3scFv氨基酸序列分析及其同源性比对结果

Bioedit翻译得到的scFv氨基酸序列如图5所示，经Igmt/v-Quest划分得知VH含有117个氨基酸，VL含有116个氨基酸。由表2和表3可知，VH和VL基因碱基序列及其推导氨基酸序列均有相对应的高同源性VH和VL，即可基本确认克隆获得的VH基因和VL基因是小鼠免疫球蛋白可变区基因，且比对结果表明VL的类型为Kappa链。

2.4scFv蛋白理化性质及其结构预测结果

通过ExPASyProteomicsTools中的ProtParam程序在线预测分析，得知scFv蛋白含有248个氨基酸，分子量为26312.05Da，理论等电点（pI）5.70。以NPS@SOPMA预测scFv蛋白的二级结构，结果显示其二级结构中含有35个α-螺旋，占总数的14.11%；28个β-折叠，占11.29%；85个延伸链，占34.28%；100个随机卷曲，占40.32%。通过SWISS-MODEL在线分析scFv氨基酸序列与模板5'GRU（ProteinDataBank编号）的同源性，结果发现二者的相似性为78.02%。由图6可看出，在scFv蛋白三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近，形成典型的抗体结构——沟槽结构，是scFv的抗原结合区域。其中红色部分为重链，蓝色部分为轻链，银色部分为柔性多肽（Linker）。

3讨论

与传统的多克隆抗体和单克隆抗体相比，scFv的分子量小，仅为传统抗体的1/5，能更好地穿透组织，可在基因水平上进行改造，且在大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞等表达系统中均能表达（Wardeta1.，1989；刘金凤等，2015；刘爱平等，2016），但scFv也存在自身缺陷，主要表现为稳定性差、亲和力不如单克隆细胞株，在原核表达系统中通常以包涵体的形式表达等（Wangeta1.，2006），进而限制其在生物医学和环境检测方面的推广应用。依据scFv基因序列的已知优势，在一定程度上可为scFv的实际应用提供优化策略。如通过分析目标物不同亲和力的氨基酸序列，可确定抗体某一区域对于目标物结合能力的影响，从而获得特异性结合位点。因此，通过对scFv蛋白的序列分析和结构解析能更精确地定位其生物功能。

目前，接近90%的蛋白结构是采用X射线衍射技术进行测定，该方法虽然能获得精确的蛋白晶体结构，但操作复杂、仪器昂贵，对抗体纯度要求高（李少晖等，2015）。隨着分子生物学和生物信息学的快速发展，基因序列信息越来越容易获得。因此，在线数字化分析系统已成为蛋白功能研究必不可少的工具。同源建模（Homologymodeling）是一种实用、可靠的蛋白质结构预测方法，通过与数据库中已知序列x射线晶体衍射比对，选取具有高度保守性的氨基酸序列，同源性在50%以上时再以理论计算方法对其进行结构优化。基于抗体的氨基酸序列和结构，对某些特定位置进行定点突变的策略可用于提高抗体亲和力。Li等（2012）通过分析抗AFBl单克隆抗体的氨基酸序列及预测其结构，发现该单克隆抗体上第49位丝氨酸（Ser）与第103位缬氨酸（Val）问的氢键和疏水作用对实现抗原与抗体的结合起重要作用。Min等（2016）在分析抗AFBlscFv氨基酸序列和结构的基础上，将VHFR4的第110位丙氨酸突变成苏氨酸（¹¹⁰Ala→Thr），其亲和力提高了3.2倍。本研究成功构建获得抗AFBlscFv基因，并采用在线生物信息学分析软件对其氨基酸序列、理化性质及蛋白结构进行分析预测，结果显示，scFv基因片段大小为744bp，其中VH片段为351bp、VL片段为348bp，经Igmt/v-Quest划分得知VH含有117个氨基酸，VL含有116个氨基酸，二者均为小鼠免疫球蛋白可变区基因：scFv蛋白含有248个氨基酸，分子量为26312.05Da，理论等电点（pI）5.70，其二级结构中含有35个α-螺旋（占14.11%）、28个β-折叠（占11.29%）、85个延伸链（占34.28%）和100个随机卷曲（占40.32%），在三级结构中连接肽卷曲将VH和VL区域牵拉而相互靠近，形成典型的抗体结构——沟槽结构，是scFv的抗原结合区域。该结果为scFv基因的表达、纯化、活性及亲和力研究等后续工作提供了重要的参考依据，也为确定关键氨基酸结合位点、改变结合部位的氨基酸序列或空间构像提供了基础信息，从而实现scFv的体外进化及提高其实际应用能力。

4结论

构建的抗AFBlscFv其VH含有117个氨基酸、VL含有116个氨基酸，具备典型抗体结构——沟槽结构，能与抗原特异性结合。

（责任编辑兰宗宝）