柑橘品种茎段离体培养条件的优化及微芽嫁接试验

吴思梦　刘冰　蒋军喜　陈椿松　熊磊　周英　鄢明峰

摘要：[目的]优化柑橘品种茎段离体培养条件并开展微芽嫁接（试管内茎尖嫁接）试验，为培育无毒柑橘组培种苗提供参考依据。[方法]对温州蜜柑和纽荷尔脐橙成年態枝条进行不同浓度HgCl₂和NaClO消毒，筛选适宜组培利用的柑橘外植体消毒方式、采集季节及激素配比；开展嫁接砧木种子消毒和微芽嫁接试验，分析两个柑橘品种微芽嫁接的萌发状况。[结果]温州蜜柑外植体的最适消毒方法为70%酒精+1.0‰HgCl₂消毒6min处理两次；纽荷尔脐橙外植体的最佳消毒方法为70%酒精+15.0%NaClO处理两次；采集成年态柑橘茎段进行离体培养的最佳时期为夏季；在MS固体培养基中添加1.0mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）和0.1mg/L萘乙酸（NAA）均有利于两个柑橘品种外植体腋芽萌发。砧木种子最适消毒方法为剥去内外种皮+70%酒精+1.5%NaClO溶液处理；两个柑橘品种微芽嫁接的萌发率较低，分别为10.00%和6.67%，但嫁接成功后柑橘苗长势良好。[结论]于夏季剪取温州蜜柑和纽荷尔脐橙成年态枝条带芽茎段，分别经70%酒精+1.0‰HgCl₂消毒6min处理两次、70%酒精+15.0%NaClO处理两次，在添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的MS固体培养基中接种，可获得最佳的培养效果。利用微芽嫁接技术嫁接的柑橘苗长势良好，可在提高其嫁接萌发率基础上推广应用。

关键词：温州蜜柑；纽荷尔脐橙；外植体消毒；微芽嫁接

中图分类号：S666.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）11-2034-05

0引言

[研究意义]我国柑橘生产规模较大，经济价值高，但近年来柑橘病害日益加重。世界上已报道的柑橘病毒和类病毒超过40种，严重影响柑橘产业的持续健康发展，而微芽嫁接（试管内茎尖嫁接）技术可脱除柑橘中的多种病害（刘科宏等，2016）。Mu-rashinge等（1972）创立了微芽嫁接技术，即利用茎尖组织培养技术结合嫁接技术获得无菌苗。茎尖组织培养是微芽嫁接的前期工作，但目前柑橘成年态茎段组织培养技术尚未成熟，组培过程中茎段污染率高且受季节影响，芽体增殖分化受激素影响，制约了相关生物技术在柑橘生产上的应用（邓才生等，2009；乔芬等，2011）。因此，优化柑橘茎段离体培养条件并开展微芽嫁接试验，对提高柑橘茎尖组织培养效率及发展柑橘产业具有重要意义。[前人研究进展]邓才生等（2009）研究认为，使用1‰HgCl₂对柑橘外植体消毒可获得理想的消毒效果；李丽（2014）研究发现，使用5%和10%NaClO对柑橘外植体进行消毒可获得较理想的消毒效果。在促进腋芽萌发方面，陈泽雄等（2007）研究发现，柑橘茎段在添加1.0mg/L6-苄氨基嘌呤（6-BA）+0.2mg/L萘乙酸（NAA）的培养基中腋芽萌发率更高；周海霞（2010）研究认为，培养基中添加1.0mg/L6-BA+0.5mg/L吲哚丁酸（IBA）+0.5mg/LGA3更有利于红江橙腋芽萌发；李丽（2014）研究发现，1.0mg/L6-BA+0.5mg/L吲哚-3-乙酸（IAA）+1.0mg/L赤霉素（GA3）更有利于柑橘腋芽萌发。在柑橘嫁接萌芽方面，罗君琴等（2011）研究发现，柑橘的嫁接萌发率为0-20%；隆雨薇（2015）研究认为，柑橘试管内嫁接萌发率较低，仅4.5%，不同品种问存在差异，嫁接萌发率亟待提高。[本研究切入点]目前，针对筛选纽荷尔脐橙和温州蜜柑茎段组织离体培养最佳消毒方法、采集时期及培养基中激素配比培育优质柑橘脱毒苗的研究报道较少，且柑橘微芽嫁接后嫁接苗萌发率较低，关于温州蜜柑和纽荷尔脐橙微芽嫁接的研究也鲜见报道。[拟解决的关键问题]以温州蜜柑和纽荷尔脐橙的成年态茎段（半木质化新梢）为外植体，筛选适合其消毒的最佳方法、最佳采集时期及培养基中的激素配比，开展嫁接砧木种子消毒和微芽嫁接试验，为培育优质柑橘无菌苗木提供参考依据。

1材料与方法

1.1试验材料

试验于2016年5月在江西农业大学农学院进行。供试温州蜜柑和纽荷尔脐橙的成年态茎段均采自江西农业大学生态园，砧木为柠檬种子。试剂：70%酒精、NaClO溶液（1.5%、5.0%、10.0%和15.O%）、1.0‰HgCl₂、蔗糖、琼脂粉、6-BA、NAA、MS培养基、MT培养基。

1.2试验方法

1.2.1外植体采集 于晴天14：00，剪取柑橘植株无病虫害、半木质化夏梢，装入洁净塑料袋带回实验室。剪去叶片，经自来水冲洗后先用洗衣粉浸泡10min，再用自来水冲洗10min。将枝条剪成8cm长的带芽茎段。

1.2.2外植体消毒及培养 分别采用5种方法对柑橘茎段进行消毒处理。其中方法A、B和C为70%酒精处理1min→（15.0%、10.0%和5.0%）NaClO灭菌20min→无菌水冲洗→放置48h→（15.0%、10.0%和5.0%）NaClO消毒30min→无菌水冲洗；方法D和E为70%酒精处理1min→1.0‰HgCl2₂消毒（3和6min）→无菌水冲洗_÷放置48h→1.0‰HgCl₂消毒（3和6min）→无菌水冲洗。经消毒的茎段插入MS固体培养基中培养，培养基添加30.0g/L蔗糖、7.0g/L琼脂和1.0mg/L6-BA。培养条件：温度（26+1）℃，光暗周期12h/12h。两个柑橘品种的每处理均使用30条外植体，3次重复。培养10d后统计萌芽率和污染率。

萌芽率（%）=萌芽且未污染数/总腋芽数×100

污染率（%）=污染数/总腋芽数x100

1.2.3外植体采集季节筛选 分别剪取温州蜜柑和纽荷尔脐橙的春梢（4～6月）、夏梢（7～8月）和秋梢（9～10月），按照1.2.1方法采集带芽茎段并分别按照

1.2.2中的方法E和方法A进行消毒和培养，10d后统计污染率。不同时期采集的每品种茎段30条，3次重复。

1.2.4激素配比筛选 分别将最優消毒方法消毒的两个柑橘品种茎段接种于下列含不同激素配比的MS固体培养基（表1）中，每处理均接种30条茎段，3次重复。12d后统计外植体的出芽数。

1.2.5砧木种子消毒与培养 微芽嫁接前需培育无菌砧木苗。选取充实饱满的柠檬种子分别进行A、B、C和D消毒处理，A为70%酒精处理30s→1.5%NaCl0溶液处理20min→无菌水清洗；B为剥去外种皮+70%酒精处理30s→1.5%NaClO溶液处理20min→剥去内种皮→无菌水清洗；C为70%酒精处理30s→1.0‰HgCl₂处理10min→无菌水清洗；D为剥去外种皮→70%酒精处理30s→1.0‰HgCl₂处理10min→剥去内种皮→无菌水清洗。

种子消毒后置于MT固体培养基中培养。培养条件为温度（264-1）℃、暗培养。每处理50粒种子，3次重复。14d后统计种子的污染率和发芽率。

污染率（%）=污染种子数/接种种子总数×100

发芽率（%）=萌芽且未污染种子数/接种种子总数×100

1.2.6微芽嫁接试验取 1.2.4中最佳激素配比培养基培养的两个柑橘品种外植体的萌芽各30个，分别与1.2.5中培养成功的砧木进行微芽嫁接，嫁接后的试管苗置于液体嫁接培养基MT中，培养基中加入75.0g/L蔗糖，用滤纸桥支撑嫁接苗在试管中培养，培养条件为温度（26±1）℃、光暗周期16h/8h。观察嫁接苗生长情况及萌发率。

1.3统计分析

试验数据采用SPSS17.0进行统计分析，以Dun-cans法进行差异显著性检验。

2结果与分析

2.1不同外植体消毒方法的消毒效果比较

由表2可知，温州蜜柑和纽荷尔脐橙外植体的最适消毒方法明显不同。其中，温州蜜柑外植体经两次1.0‰HgCl2消毒6min（E方法）的污染率最低，为20.21%，萌芽率最高，为64.62%；减少HgCl2消毒时间（D方法）的温州蜜柑外植体污染率显著升高（P<0.05，下同），萌芽率显著降低；温州蜜柑外植体经NaClO消毒（A、B和c方法）的污染率显著高于HgCl2消毒6min，说明温州蜜柑外植体消毒应选择用两次1.0‰HgCl₂消毒6min。经两次15.0%NaClO消毒（A方法）的纽荷尔脐橙外植体污染率为19.08%，与HgCl2消毒6min的污染率差异不显著（P>0.05），萌芽率显著高于HgCl₂消毒6min；随着NaClO浓度的下降（B和C方法），污染率显著升高，萌芽率显著降低，说明纽荷尔脐橙外植体消毒方式应选择15.0%NaClO消毒两次。

2.2不同外植体采集季节对消毒效果的影响

表3结果表明，温州蜜柑和纽荷尔脐橙的外植体消毒效果均受季节影响。温州蜜柑夏梢的污染率为20.21%，显著低于春梢的33.57%和秋梢的29.67%；纽荷尔脐橙夏梢的污染率（19.08%）也显著低于春梢（38.75%）和秋梢（39.49%）。说明夏季采集的外植体消毒效果更理想，更有利于组织培养。理的出芽数显著高于其他两个6-BA浓度处理，说明6-BA诱导芽体萌发的最佳浓度为1.0mg/L；不同浓度NAA对芽体萌发的影响差异较小，其中，6-BA浓度为1.0mg/L时，0.1、0.5和1.0mg/LNAA处理的出芽数差异不显著。

2.3不同激素配比对外植体萌芽效果的影响

由表4可知，6-BA和NAA浓度分别为1.0和0.1mg/L时，两个柑橘品种外植体腋芽的萌芽情况最佳，温州蜜柑和纽荷尔脐橙的出芽数分别为3.72和3.59个；NAA浓度为0.1mg/L时，1.0mg/L6-BA处

2.4不同消毒方法对砧木种子萌发的影响

由表5可知，剥去内外种皮、用1.5%NaClO消毒（B方法）的砧木种子污染率为3.47%，发芽率为96.30%，未剥去内外种皮、用1.5%NaClO溶液消毒（A方法）的砧木种子污染率为5.56%，发芽率为89.19%，两种消毒方法的污染率和发芽率均存在显著差异，说明剥去种子的内外种皮能解除休眠，有效促进种子萌发；HgCl2消毒虽可获得更低的污染率，但发芽率也更低。因此，柑橘嫁接砧木种子的最适消毒方法为剥去内外种皮，并使用1.5%NaClO溶液消毒。

2.5微芽嫁接结果

两个柑橘品种进行微芽嫁接各30株，其中，温州蜜柑嫁接成功3株，萌发率为10.00%；纽荷尔脐橙嫁接成功2株，萌发率为6.67%，两个品种的萌发率均偏低。嫁接成功后1个月，嫁接苗叶片展开，嫁接后2个月，多数叶片展开，生长情况良好（图1）。

3讨论

成年态柑橘茎段携带有大量微生物，进行组织培养后易产生污染，找寻适当的消毒方法降低外植体污染率是进行后续组培研究的前提。多数文献指出，使用最佳消毒方法对柑橘成年态外植体进行消毒，其污染率仍达10%～30%（徐定华等，2007；Shok-rollahetal，2009；胡选萍和陈志远，2014；HilfandLewis，2016）。本研究中，两个柑橘品种外植体均进行两次消毒，第1次消毒时，部分微生物未被彻底杀死，放置48h后，多数菌体萌发，但在第2次消毒中被杀死，有效提高了消毒效果；纽荷尔脐橙茎段使用10%NaClO溶液消毒，污染率为23.52%，与王子成等（2005）对脐橙茎段进行灭菌的污染率（24.88%）相近。罗君琴等（2007）研究认为，温州蜜柑外植体使用HgCl₂消毒时间过短则灭菌效果不佳，污染率较高，影响萌芽；灭菌时间超过6min，消毒液的毒害作用会导致萌芽率下降，以灭菌6min的效果较佳，萌芽率为57.5%。本研究结果与其相似，经HgCl₂消毒6min的温州蜜柑外植体萌芽率为64.62%。

本研究结果表明，外植体采集季节对污染率有较大影响，以夏季采集茎段的消毒效果最佳，温州蜜柑污染率仅20.21%，纽荷尔脐橙污染率仅19.08%，低于李丽（2014）对夏季柑橘外植体消毒后的污染率（30.0%）。江西省春季温暖且湿度较大，有利于微生物生长繁殖；夏季温度高，干燥炎热，微生物活力下降、数量减少；秋季温度适宜，微生物又快速繁殖，因此，采集柑橘茎段进行离体培养的最佳时期应为夏季。在组织培养过程中，诱导成年态柑橘茎段萌芽存在一定难度，培养基中的激素配比对外植体萌发有一定影响（WuandXia，2005）。6-BA可促进芽的生长分化，如陈泽雄等（2007）研究发现，MS培养基中添加1.0mg/L6-BA的柑橘茎段平均出芽数最多；李凯等（2011）研究发现，NAA和6-BA的良好配比能使芽的分化效果达到最佳，1.0mg/L6-BA与0.2mg/LNAA配比下化州橘红茎段的出芽数为3.0個。本研究中，在MS培养基中添加1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA的温州蜜柑和纽荷尔脐橙茎段出芽数最多，分别为3.72和3.59个，与陈泽雄等（2007）、李凯等（2011）的研究结果相似。

微芽嫁接是将不带毒的茎尖分生组织嫁接到不带毒的砧木苗上进行试管培养以获得无毒苗木的一项嫁接技术，可解决组培苗生根难、生长慢等问题，其前提是需培育无菌砧木（陈洪明等，2014）。本研究中，微芽嫁接所用砧木为以新鲜柠檬种子经脱去内外种皮减少其萌发阻力，打破休眠，并使用NaClO消毒后培育而成，污染率较低，培养效果较佳，为微芽嫁接打下了基础，与罗君琴等（2010）的研究结果相似。本研究中微芽嫁接成功率较低，温州蜜柑和纽荷尔脐橙嫁接苗的萌发率仅分别为10.00%和6.67%，但嫁接成功后的柑橘苗长势良好，与罗君琴等（2007）、隆雨薇（2015）的研究结果相似。因此，后续研究需重点解决微芽嫁接萌发率低的问题。

4结论

于夏季剪取温州蜜柑和纽荷尔脐橙成年态带芽茎段，分别经70%酒精+1.0‰HgCl₂消毒6min处理两次，70%酒精+15.0%NaClO处理两次，在添加1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA的MS固体培养基中接种，可获得较佳的培养效果。利用微芽嫁接技术嫁接的柑橘苗长势良好，可在提高其嫁接萌发率基础上推广应用。

（责任编辑思利华）