Clinprot技术筛选帕金森病血清标志物的研究

郑明慧 李竞 鲍蕴文 潘昆贻 朱树华 胡坤华

【摘要】目的利用液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术（CLINPROTTM MALDI-TOF/TOF MS，Clinprot技术）寻找帕金森病敏感的血清分子标志物。方法对51例帕金森病患者的血清和51例性别、年龄相匹配的正常对照者血清进行Clinprot技术分析， 选择P≤0.05和表达差异大于2倍的蛋白峰进行质谱分析。采用遗传算法建立疾病诊断模型，验证模型敏感度和特异度。结果成功建立了帕金森病和正常血清的疾病诊断模型， 模型特异度为98.45%，敏感度为91.83%。采用Clinprot技术同时找到5个感兴趣的蛋白差异峰，相对分子量分别为1 946、2 211、2 368、4 055和4 212，通过二级质谱检索Mascot数据库获得匹配蛋白，分别为核苷二磷酸激酶6、睾丸表达序列13B蛋白、核糖核酸酶7、THAP结构域蛋白3、氨转运蛋白Rh型C蛋白。结论Clinprot技术能够客观显示出帕金森病患者与正常对照者血清差异蛋白，该研究鉴定出的5种蛋白有望成为帕金森病诊断的新分子标志物。

【关键词】帕金森病；液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术；蛋白质组学

【Abstract】ObjectiveTo utilize the matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry technique（CLINPROTTM MALDI-TOF/TOF MS， Clinprot technique）to identify the sensitive serum molecular biomarkers of Parkinsons disease. MethodsThe serum samples of 51 patients with Parkinsons disease and 51 gender- and age-matched healthy controls were collected and subject to Clinprot technique analysis. The protein peaks with P≤0.05 and differential expression of a >2-fold change were analyzed by MALDI-TOF/TOF MS. The diagnostic model of Parkinsons disease was established by genetic algorithm. The sensitivity and specificity of the diagnostic model were validated. ResultsThe diagnostic models of Parkinsons disease and normal serum were successfully established. The specificity was calculated as 98.45%， and 91.83% for sensitivity. Clinprot technique was used to detect 5 differentially-expressed protein peaks （1 946 Da， 2 211 Da， 2 368 Da， 4 055 Da and 4 212 Da）. The matched proteins were retrieved from the Mascot database including nucleoside diphosphate kinase 6， testis-expressed sequence 13B protein， ribonuclease 7， THAP domain-containing protein 3 and ammonium transporter Rh type C. ConclusionClinprot technique can objectively identify the differentially-expressed proteins between Parkinsons disease patients and normal controls. The five proteins identified in this investigation might become novel molecular biomarkers for the diagnosis of Parkinsons disease.

【Key words】Parkinsons disease； Clinprot technique； Proteomics

帕金森病是中老年神經变性疾病之一，中国发病人数约199万，且逐年增加[1]。本病病理本质是黑质纹状体多巴胺能神经元进行性缺失。当多巴胺能神经元不足50%时患者开始出现临床症状，表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态障碍[2]。目前本病的病因和发病机制尚未明确，可通过病史、临床症状，结合CT或MRI，以及检测对左旋多巴药物的反应性达到诊断目的，但此时疾病往往已经发展为中晚期，疗效差。早期发现早期治疗可获得良好效果，是影响帕金森病预后的关键，但现阶段缺乏早期诊断手段，因此急需寻找一些更灵敏，特异度更高的分子标志物，以达到早期诊断的目的[3-5]。液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术（CLINPROTTM MALDI-TOF/TOF MS，Clinprot技术）已被广泛应用于寻找疾病分子标记物的研究，例如子宫内膜异位症、乳腺癌、肝癌等，旨在从源头寻找高效灵敏的分子标记物[6-8]。在本研究中，笔者以帕金森病患者和正常者血清为研究对象， 对其进行Clinprot技术分析， 初步筛选帕金森病发生发展相关的差异蛋白质。

对象与方法

一、研究对象

对2014年4月至2016年12月中山大学孙逸仙纪念医院的帕金森病患者进行筛选，纳入标准： ①符合2006年中华医学会神经病学分会运动障碍及帕金森病学组所制订的帕金森病诊断标准；②均行CT或MRI检查，除有老年性脑改变外，未见其它特殊异常；③排除肿瘤、周围神经炎以及脑部病变等原因所导致的帕金森综合征。符合上述标准的患者51例为帕金森病组，其中男31例、女20例，年龄（61.5±5.0）岁，病程（4±2）年。另纳入51例来源于中山大学孙逸仙纪念医院体检中心、经体检明确无心脑血管及帕金森病的性别、年龄与帕金森病组相匹配的正常老年人为正常对照组。本研究经中山大学孙逸仙纪念医院医学伦理委员会批准，所有研究对象（或其家属）均签署知情同意书。

二、仪器及材料

Ultraflex Ⅲ TOF/TOF布魯克质谱仪、Clinprot软件、AnchorChipTM质谱靶、磁珠分离器；磁珠试剂盒Profiling Kit 100 MB-WCX、标准品1 Peptide Calibration Standard、标准品2 Protein Calibration Standard I、基质a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，均购自布鲁克道尔顿公司。

三、方法

采用Clinprot技术对2组受试者的血清样本进行磁珠分离和质谱检测，分组建立疾病模型，寻找差异蛋白峰。

1.血清样本制备

于清晨空腹抽取所有受试者外肘静脉血2 ml到无抗凝管内，室温静置2 h；当血液凝固后，离心300转/分，小心将上清（即为血清）吸出，分装，于-80℃储存备用。

2.样本磁珠处理

于4℃取出磁珠试剂盒复温，完全混匀WCX免疫磁珠悬浮液，然后取出10 μl磁珠液，加入10 μl磁珠结合缓冲液（BS），混匀，再加入5 μl血清样本，吹打5次混匀，于室温静置5 min。将样品管放入磁珠分离器，使磁珠贴壁1 min，吸掉液体。

往样品管加入洗脱液100 μl，磁珠分离器来回移动10次，静止1 min，去除未结合的杂质。重复操作2次。

从磁珠分离器上取下样品管，加入5 μl磁珠洗脱缓冲液（ES），混匀贴壁的磁珠，反复吸打10次，放置磁珠分离器2 min，磁珠与悬浮的液体充分分离后，将上清液移入干净的1.5 ml离心管，加入 5 μl稳定缓冲液（SS），吸打混匀。

3.点样上机

分别取2 μl磁珠洗脱液和2 μl标准品（肽段标准品∶蛋白标准品以1∶5比例混合）与10 μl肉桂酸基质溶液[浓度0.3 g/L，溶剂为2∶1的乙醇∶乙腈]，充分混匀。取上述混合液2 μl到直径为600 μm的AnchorChipTM 600/384质谱靶上，室温干燥。启动质谱仪，校正仪器，放入质谱靶进行检测。

4.质谱图谱采集

采用质谱FlexControl 3.3软件采集磁珠分选后的血清蛋白样本的肽指纹图谱：线性采集模式为LP-Clinprot，电压为25 kV，用标准品校正系统，测量范围为0～10 kDa，激光频率为200 Hz，相对强度为40%～60%，使用软件FlexAnalysis 3.3进行标峰，并进行基线和平滑处理，使数据校正和归一化。

5.质谱图统计学处理

把质谱图谱用软件ClinproTools 2.2分析，首先进行样本分组（帕金森病组和正常对照组），接着利用GA基因遗传算法，神经网络算法SNN，快速分类算法QC分别建立疾病模型，并比较模型之间的敏感度和特异度。进一步对质谱数据进行t检验，计算出蛋白峰的组间差异程度，选择满足P≤0.05和差异倍数>2.0的峰作为有统计学意义的差异蛋白峰。

6.蛋白质的鉴定

利用LIFT软件对差异蛋白峰进行二级串联质谱（MS/MS）分析鉴定， 离子源加速电压1为8.0 kV，加速电压2为7.1 kV，LIFT1电压为19 kV， LIFT2电压为2.95 kV，频率为200 Hz。使用Biotools软件检索获得的图谱，以Mascot为搜索引擎，数据库为NCBInr、种属为人，质量误差范围为0.5 Da。

蛋白质组学技术飞速发展，已被广泛应用于帕金森病的病因学研究，包括双向电泳、高效液相色谱-电喷雾三重四极杆质谱法、同位素相对标记与绝对定量技术、表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术等，揭示了SNCA、DJ-1、LRRK2等重要蛋白质与帕金森病发生的潜在关系。对于帕金森病患者血清、脑脊液的蛋白质组学研究，更有助于发现特异度和灵敏度高的生物学标志物，对帕金森病的早期诊断、治疗及预防具有重要的临床价值[10]。双向电泳根据分子量和等电点分离蛋白质，具有可重复性好、结果直观、实验成本较低的特点，已成为蛋白质组学研究中最常用的分离技术。然而，该技术需凭借凝胶为载体，仅适用于研究高峰度表达和高分子量段多肽及蛋白，不适用于鉴定低丰度蛋白；对于小分子蛋白特别是分子量低于3 000 Da小肽段，高效液相色谱/固相色谱很难通过全蛋白组胰蛋白酶消化方式检出；表面增强激光解吸电离飞行时间质谱技术诊断效率较高，但技术的重复性差，灵敏度欠佳[11-13]。

Clinprot技术是蛋白质组学技术的有效补充，其专门针对临床体液。因为血清取材方便，从血清中发现相关标志物是目前诊断疾病的有效途径，高丰度蛋白质如白蛋白和免疫球蛋白约占血清蛋白总量的80%～90%，但能反映机体状况的血清蛋白质多属于低丰度蛋白质，而这类蛋白质难于鉴定，这已经成为蛋白质组学发展的瓶颈。Clinprot技术针对这类问题应运而生，通过磁珠分离，直接去除样品中的高丰度蛋白，同时富集低丰度蛋白，再结合多级质谱分析，直接鉴定差异蛋白。其优势为：①高灵敏度、高分辨率，1滴血（10～50 μl）即可检测低至1 fmol的蛋白；②操作简单，重复性好，高通量的特性[14]。

睾丸表达序列13B蛋白的功能尚未明确，通常被认为与编码精原细胞表达相关[15]。此蛋白在帕金森病患者血清中的表达升高，推断可能与帕金森病好发于男性有关。核糖核酸酶7具有强大的RNA酶活性，具有广谱的抗微生物活性[16]。帕金森病本身是一类神经免疫性疾病，表现为小胶质细胞大量激活损伤多巴胺神经元，核糖核酸酶7在帕金森病患者血清中的表达升高，可能起抗炎保护作用[17]。核苷二磷酸激酶6的功能在于从三磷酸核苷转变为二磷酸核苷时转移磷酸基团，产生ATP，帕金森病也是线粒体病，核苷二磷酸激酶6下调会导致ATP产生障碍，进而损伤呼吸链，这提示核苷二磷酸激酶6与帕金森病的发病密切相关[18]。THAP结构域蛋白3是THAP1/THAP3-HCFC1-OGT complex的成分之一，参与调控核糖核酸氧化还原酶M1亚基的转录活性。核糖核酸氧化还原酶M1在调节DNA合成中起重要作用，该蛋白表达下调可能与酪氨酸羟化酶的转录水平降低有關，从而导致多巴胺神经元选择性死亡[19]。氨转运蛋白Rh型C蛋白属于氨转运相关蛋白，近年来帕金森病也被认为是一类代谢性疾病，与锰、铁代谢失衡相关，推测可能与氨转运代谢相关，以上推测有待进一步研究证实[20-22]。

至今，国内外均未有以上5个蛋白与帕金森病相关的文献报道，我们下一步拟扩大样本量，进一步证实本研究结论的可靠性，同时利用ELISA、免疫荧光原位等技术继续探讨这些蛋白与帕金森病之间的关系，为帕金森病的临床诊疗提供有效依据。

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（收稿日期：2017-09-01）

（本文编辑：洪悦民）