PTPN9在肝癌中的表达及临床意义

李晓华 张英才 邓宜南 杨晓星 张琪 杨扬 周奇

【摘要】目的探讨非受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶9（PTPN9）在肝癌中的表達及临床意义。方法利用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR 的方法检测8例原发性肝癌组织及癌旁组织中PTPN9的表达情况，另外收集129例肝癌手术标本的临床病理资料，利用免疫组织化学检测PTPN9在组织中的表达并进行统计分析。结果肝癌中PTPN9的蛋白及mRNA表达量低于癌旁组织（t=4.833，P<0.01）。临床资料分析显示肝脏组织中PTPN9的表达量是肝癌预后的影响因素，PTPN9的表达越低，患者预后越差。结论PTPN9基因在肝癌组织中表达明显下调，PTPN9的表达越低，患者预后越差。

【关键词】肝癌； 非受体型蛋白质酪氨酸磷酸酶9

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression level and clinical significance of protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9 （PTPN9） in liver cancer. MethodsWestern blot and RT-PCR were adopted to quantitatively measure the expression levels of PTPN9 in the primary liver cancerous and para-cancerous tissues from 8 cases. Clinicopathological data of 129 surgical specimens were collected. Immunohistochemical staining was performed to quantitatively detect and statistically compare the expression levels of PTPN9 between the liver cancerous and para-cancerous tissues. ResultsIn the liver cancerous tissues， the expression levels of PTPN9 protein and mRNA were significantly down-regulated compared with those in the para-cancerous tissues （t=4.833， P<0.01）. Analysis of clinical data revealed that the expression level of PTPN9 in the liver tissues was an independent factor of the clinical prognosis of liver cancer patients. The lower the expression level of PTPN9 was， the worse clinical prognosis was. ConclusionsThe expression level of PTPN9 gene is significantly down-regulated in liver cancerous tissues. The lower the expression of PTPN9 is， the worse the clinical prognosis is.

【Key words】Liver cancer； Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 9

肝细胞癌是原发性肝癌的主要类型， 是最常见的恶性肿瘤之一， 在全球消化系统肿瘤中，病死率占第三位[1-2]。在我国其病死率在消化系统恶性肿瘤中排第二位，其发病率呈上升趋势，目前，肿瘤切除及肝脏移植是最有效的治疗手段，射频消融及化学治疗等可改善癌症患者的预后，尽管这些治疗手段可减少患者的病死率，但肝癌患者术后的复发及化学治疗的耐药仍然是需要迫切解决的问题[3]。研究认为，肝癌的发生和发展与信号通路的紊乱有着紧密的联系，PTPN9作为蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）非受体家族中的重要成员，负向调控多种生物信号通路， 参与了多种病理生理过程，但其在肝癌发生发展中的作用及调控机制尚待阐明[4-5]。本研究通过免疫组织化学（组化）检测PTPN9在组织中的表达，探讨其与肝癌预后的关系，以期为早期诊断及治疗提供依据。

材料与方法

一、材料

收集南昌大学第一附属医院手术切除的新鲜原发性肝癌标本，包括肝癌及其距肝癌1 cm的癌旁肝组织标本，本研究中石蜡病理标本129例肝癌标本临床资料从中山大学肿瘤防治中心病理科获得。随访终点为死亡、 失访或生存至截止日期， 随访期间的失访者算作删失值。自确诊至患者死亡之间的时间定义为总生存时间（OS）。本研究经我院医学伦理委员会批准。

二、方法

1.蛋白免疫印迹法

收集蛋白样品后，在10%～12%的凝胶中制备并分离蛋白质样品。转移到PVDF膜（Millipore， Boston， USA），然后被牛血清白蛋白阻断。在4℃下，抗体PTPN9（Santa Cruz， USA）和β-actin（Santa Cruz， USA）孵育过夜。用TBST对膜进行清洗，在室温下用山羊抗兔二次抗体孵育。最后，对膜进行了曝光。

2.实时荧光定量PCR（RT-PCR）

提取肝脏组织RNA，按说明书（南京凯基公司）成份准备RT反应液（所有液体配制均应在冰上进行），合成cDNA，将得到的cDNA溶液作为模板加入到说明书的PCR反应体系中，预变性：95℃ 30 s。PCR反应：（95℃ 5s；60℃ 20 s）×45个循环。

3.免疫組化及评分

石蜡切片脱蜡置水，3%H2O2，室温孵育消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，5% 正常山羊血清封闭，室温孵育 10 min，滴加一抗 4 ℃ 过夜。滴加生物素标记二抗工作液，显色剂显色3 min，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。PTPN9蛋白水平检测采用H-score法。阳性细胞的百分率为“0”（0%）、“1”（1%～25%）、“2”（26%～50%）、“3”（51%～75%）、“4”（76%～100%）。强度评分为“0”（阴性染色）、“1”（弱染色）、“2”（中度染色）和“3”（强染色）。两名病理学医师在不了解患者的临床和病理变量的情况下，以双盲方式独立地评价了所有的切片。

三、统计学处理

采用SPSS 13.0进行统计分析。配对设计的定量资料组间比较采用配对t检验，组间构成比的比较采用Fisher确切概率法。Kaplan-meier法绘制生存曲线并做对比（Log-rank test）。采用Cox比例风险回归模型来确定预后影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

四、肝癌预后的多因素分析

PTPN9高表达与PTPN9低表达患者的kaplan meier累积生存曲线显示，PTPN9表达越低，生存时间越短，见图4，影响肝癌患者预后的多因素分析显示，PTPN9被认为是肝癌患者总体生存率的保护因素（HR= 0.453，95% CI 0.275～0.744，P=0.002），见表2。

讨论

近年来，人们越来越多地致力于揭示肝细胞癌发生发展的机制，旨在探索肝癌临床治疗的新策略。

在人类基因组中，PTP家族含有107个成员，PTP在细胞多种功能方面都起着关键的作用，也被认为是新一代的药物靶点[6-11]。PTP主要通过逆转蛋白质酪氨酸激酶的作用并一起调控蛋白质酪氨酸磷酸化过程，调控细胞的生长、分化、迁移、存活、凋亡， 许多研究表明，PTP功能的失调及基因的修饰可导致癌症及自身免疫性疾病的发生[12-16]。研究证实，PTPN12的低表达与肝癌的复发及预后成正相关，降低肝癌细胞中的PTPN11会增加肝癌细胞对顺铂及氟尿嘧啶的耐药性，而PTPN9作为PTP非受体家族中的一员，位于染色体15q24.2，含有N末端结构域，可特异性结合磷脂酰丝氨酸调节凋亡细胞的吞噬过程，与底物VEGFR2结合，可负向调控内皮细胞的VEGFR2信号通路[17-20]。在乳腺癌中研究发现，PTPN9直接作用于底物STAT3和EGFR而抑制其磷酸化，在乳腺癌发生及发展过程中起着重要作用[21-22]。

研究证实STAT3转录因子参与肝癌的发展，在肝癌组织中STAT3可持续性激活，STAT3的缺失可缓解肝癌的生长，其主要作用机制是调控细胞周期因子的转录，如细胞周期蛋白D1等[23-24]。而PTPN9作为调控STAT3的重要基因，其在肝癌中的作用仍然不清楚，在本研究中，我们发现PTPN9在肝癌表达中明显下调，有研究证实，多个miRNA 可调控PTPN9的表达，但其在肝癌中下调的机制有待于进一步研究[25]。我们进一步通过免疫组化技术对肝癌组织芯片中129例组织PTPN9的表达情况进行分析，并结合临床数据分析显示肝脏组织中PTPN9的表达量是肝癌的预后的影响因素，PTPN9的表达越低，患者预后越差。这可能表明PTPN9在肝癌发生发展中起到重要作用。因此，继续深入研究PTPN9在肝癌中的作用机制，探讨其作用底物是下一步研究的关键。

由于本研究为回顾性研究，在患者选择上可能有选择性偏倚，需要多中心大量标本的长期临床研究。

参考文献

[1]Siegel R， Naishadham D， Jemal A.Cancer statistics for Hispanics/Latinos， 2012.CA Cancer J Clin，2012，62（5）：283-298.

[2]薛才林，杨涛，古诚鑫，蒋小峰，钱世鹍，刘世明，杨辉. 溴结构域蛋白4抑制剂JQ1促使肝癌细胞侵袭迁移的分子机制. 新医学，2017，48（7）：443-448.

[3]Bruix J， Gores GJ， Mazzaferro V.Hepatocellular carcinoma： clinical frontiers and perspectives. Gut，2014，63（5）：844-855.

[4]Ma L， Ji L， Yu Y， Wang J.Novel molecular targets for diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma. Discov Med，2015，19（102）：7-14.

[5]杨文丽，申旺，廖悦华，孙丽霞，余卫东，刘琼茹. GPC3在乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒相关性肝癌组织中的表达及其意义. 新医学，2016，47（7）：452-456.

[6]Lee H， Yi JS， Lawan A， Min K， Bennett AM.Mining the function of protein tyrosine phosphatases in health and disease.Semin Cell Dev Biol，2015，37：66-72.

[7]Hendriks WJ， Elson A， Harroch S， Pulido R， Stoker A， den Hertog J. Protein tyrosine phosphatases in health and disease. FEBS J，2013，280（2）：708-730.

[8]Zhang D， Marlin MC， Liang Z， Ahmad M， Ashpole NM， Sonntag WE， Zhao ZJ， Li G.The protein tyrosine phosphatase MEG2 regulates the transport and signal transduction of tropomyosin receptor kinase A. J Biol Chem，2016，291（46）：23895-23905.

[9]Penafuerte C， Feldhammer M， Mills JR， Vinette V， Pike KA， Hall A， Migon E， Karsenty G， Pelletier J， Zogopoulos G， Tremblay ML.Downregulation of PTP1B and TC-PTP phosphatases potentiate dendritic cell-basedimmunotherapy through IL-12/IFNγ signaling. Oncoimmunology，2017，6（6）：e1321185.

[10]He RJ， Yu ZH， Zhang RY， Zhang ZY. Protein tyrosine phosphatases as potential therapeutic targets. Acta Pharmacol Sin， 2014， 35（10）：1227-1246.

[11]Kim M， Baek M， Kim DJ.Protein Tyrosine signaling and its potential therapeutic implications in carcinogenesis. Curr Pharm Des，2017 Jun 15.[Epub ahead of print]

[12]Zhao S， Sedwick D， Wang Z.Genetic alterations of protein tyrosine phosphatases in human cancers. Oncogene，2015，34（30）：3885-3894.

[13]Andersen JN， Jansen PG， Echwald SM， Mortensen OH， Fukada T， Del Vecchio R， Tonks NK， Mller NP.A genomic perspective on protein tyrosine phosphatases： gene structure， pseudogenes， and genetic disease linkage. FASEB J，2004，18（1）：8-30.

[14]Sharma Y， Bashir S， Bhardwaj P， Ahmad A， Khan F.Protein tyrosine phosphatase SHP-1： resurgence as new drug target for human autoimmune disorders. Immunol Res，2016，64（4）：804-819.

[15]Bollu LR， Mazumdar A， Savage MI， Brown PH. Molecular pathways： targeting protein tyrosine phosphatases in cancer. Clin Cancer Res，2017，23（9）：2136-2142.

[16]Zhang ZY.Drugging the undruggable： therapeutic potential of targeting protein tyrosine phosphatases. Acc Chem Res，2017，50（1）：122-129.

[17]Luo RZ， Cai PQ， Li M， Fu J， Zhang ZY， Chen JW， Cao Y， Yun JP， Xie D， Cai MY. Decreased expression of PTPN12 correlates with tumor recurrence and poor survival of patients with hepatocellular carcinoma. PLoS One，2014，9（1）：e85592.

[18]Yan J， Zhou Y， Chen D， Li L， Yang X， You Y， Ling X.Effects of mitochondrial translocation of telomerase on drug resistance in hepatocellular carcinoma cells. J Cancer，2015，6（2）：151-159.

[19]Zhao R， Fu X， Li Q， Krantz SB， Zhao ZJ.Specific interaction of protein tyrosine phosphatase-MEG2 with phosphatidylserine. J Biol Chem，2003，278（25）：22609-22614.

[20]Hao Q， Samten B， Ji HL， Zhao ZJ， Tang H. Tyrosine phosphatase PTP-MEG2 negatively regulates vascular endothelial growth factorreceptor signaling and function in endothelial cells. Am J Physiol Cell Physiol，2012，303（5）：C548-C553.

[21]Yuan T， Wang Y， Zhao ZJ， Gu H.Protein-tyrosine phosphatase PTPN9 negatively regulates ErbB2 and epidermalgrowth factor receptor signaling in breast cancer cells. J Biol Chem，2010，285（20）：14861-14870.

[22]Su F， Ren F， Rong Y， Wang Y， Geng Y， Wang Y， Feng M， Ju Y， Li Y， Zhao ZJ， Meng K， Chang Z.Protein tyrosine phosphatase Meg2 dephosphorylates signal transducer and activator of transcription 3 and suppresses tumor growth in breast cancer. Breast Cancer Res，2012，14（2）：R38.

[23]Hung MH， Tai WT， Shiau CW， Chen KF.Downregulation of signal transducer and activator of transcription 3 by sorafenib： a novel mechanism for hepatocellular carcinoma therapy. World J Gastroenterol，2014，20（41）：15269-15274.

[24]Sharma Y， Ahmad A， Bashir S， Elahi A， Khan F.Implication of protein tyrosine phosphatase SHP-1 in cancer-related signaling pathways. Future Oncol，2016，12（10）：1287-1298.

[25]Hong Y， Liang H， Uzair-Ur-Rehman， Wang Y， Zhang W， Zhou Y， Chen S， Yu M， Cui S， Liu M， Wang N， Ye C， Zhao C， Liu Y， Fan Q， Zhang CY， Sang J， Zen K， Chen X.miR-96 promotes cell proliferation， migration and invasion by targeting PTPN9 in breast cancer. Sci Rep，2016，6：37421.

（收稿日期：2017-06-06）

（本文編辑：杨江瑜）