冠状动脉微循环障碍加速大鼠心肌梗死后不良心室重构的机制研究

郭文玉 彭长农 柯晓 邹春霞 王小庆

【摘要】目的探討大鼠心肌梗死后合并冠状动脉微循环障碍出现心室重构与心功能变化的关系及可能的机制。方法使用月桂酸钠构建冠状动脉微循环障碍模型，行前降支血管结扎建立心肌梗死模型，40只SD大鼠随机分为4组，分别为假手术组（Sham组）、心肌梗死组（MI组）、微循环障碍组（CMD组）、心肌梗死+微循环障碍组（MI+CMD组），4周后行UCG测量左室收缩末径（LVESD）及舒张末径（LVEDD）、LVEF，取心肌组织行组织病理学检查、免疫组织化学染色（免疫组化），并采用蛋白免疫印迹法检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果与Sham组大鼠比较，其余3组的LVEDD和LVESD均升高，LVEF下降（P均<0.05），MI+CMD组改变最为明显。病理组织学及免疫组化均提示与MI组或CMD组比较，MI+CMD组心肌纤维化程度及胶原表达水平最高；在蛋白表达方面，与Sham组相比，其余3组大鼠心肌Bax蛋白表达水平增加，而Bcl-2蛋白表达水平降低（P<0.05），其中MI+CMD组Bax蛋白表达水平最高，而Bcl-2蛋白表达水平最低。结论微循环障碍可影响心肌梗死后左心室重构，其加重左心室重构可能的机制包括诱导心肌细胞的凋亡、加重心肌胶原沉积以及促进心肌纤维化进展。

【关键词】冠状动脉微循环障碍；细胞凋亡；心室重构；Bax；Bcl-2

【Abstract】ObjectiveTo investigate the relationship and potential mechanism between ventricular remodeling and cardiac function variation after myocardial infarction complicated with coronary microcirculation dysfunction in rat models. MethodsThe rat models with coronary microcirculation dysfunction were established by sodium laurate. The myocardial infarction models were established by the ligation of descending anterior branch vessels. Forty SD rats were randomly divided into four groups including the sham surgery group （Sham）， myocardial infarction group （MI）， coronary microcirculation dysfunction group （CMD） and myocardial infarction+coronary microcirculation dysfunction group （MI+CMD）. At postoperative 4 weeks， the left ventricular end-systolic diameter （LVESD）， the left ventricular end-diastolic diameter（LVEDD） and the left ventricular ejection fraction （LVEF） were quantitatively measured by echocardiogram. The myocardial tissues were subject to histopathological examination， immunohistological staining and detection of Bax and Bcl-2 proteins by western blot. ResultsCompared with the Sham group， the LVEDD and LVESD in the other three groups were significantly elevated， whereas the LVEF tended to decrease， especially the MI+CMD group （all P<0.05）. Histopathological and immunohistochemical staining prompted that compared with the MI or CMD group， the severity of myocardial fibrosis and the expression level of collagen in the MI+CMD group were the most significantly up-regulated. Compared with the Sham group， the expression levels of the Bax protein were significantly up-regulated， whereas the expression levels of Bcl-2 protein were dramatically down-regulated in the other three groups （all P<0.05）. The highest expression of Bax protein and the lowest expression of Bcl-2 protein were detected in the MI+CMD group. ConclusionsCoronary microcirculation dysfunction exerts a regulatory effect on the left ventricular remodeling after myocardial infarction. The underlying mechanisms probably include induction of myocardial cell apoptosis， aggravating collagen deposition and promoting the progression of myocardial fibrosis.

【Key words】Coronary microcirculation dysfunction； Apoptosis； Ventricular remodeling； Bax； Bcl-2

心肌梗死是威胁人类健康的重大疾病之一，心肌梗死后的心力衰竭和心脏破裂是冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）致死、致残的重要原因[1]。目前，AMI的再灌注治疗已使冠心病患者预后获得了极大的改善[2]。然而临床实践中发现，即使心外膜冠状动脉再通，仍有相当一部分患者出现心脏进行性扩大、心功能恶化，这与心肌微血管损伤和微循环灌注障碍密切相关，提示冠状动脉微循环障碍（CMD）可能参与心室重构，影响心功能。本研究中使用月桂酸钠构建CMD模型，探讨大鼠心肌梗死后合并CMD与心室重构及心功能变化的关系，以及可能的相关分子机制，现报告如下。

材料与方法

一、实验动物

健康无特定病原体（SPF）级SD雄性大鼠40只，体质量220～260 g，由中山大学北校区动物中心提供。本研究实验动物处置全程依照中山大学实验动物福利和伦理学要求，在SPF级动物房完成。

二、 试剂及仪器

月桂酸钠购自广州艾斯金科技有限公司，3%戊巴比妥钠、安定注射液、生理盐水购自中山大学附属第一医院，兔抗大鼠Bax、Bcl-2单克隆抗体购自美国CST公司，兔抗大鼠CD31、Collagen I多克隆抗体购自英国Abcam公司，免疫组织化学染色（免疫组化）链霉亲和素-生物素复合物（SABC）试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；小动物呼吸机购自美国Harvard Aparatus公司，小动物手术器械购自上海器械集团有限公司。

三、 实验方法

1.动物分组

将40只SD大鼠按随机数字表法分为4组：假手术组（Sham组）、心肌梗死组（MI组）、微循环障碍组（CMD组）、心肌梗死+微循环障碍组（MI+CMD组）。Sham组仅行假手术，不建立模型；MI组仅行前降支血管结扎建立心肌梗死模型；CMD组仅通过月桂酸钠诱导大鼠冠状动脉微血栓形成模型；MI+CMD组先建立心肌梗死模型后，再诱导冠状动脉微血栓形成模型。

2.模型制备

4组大鼠均予腹腔麻醉后行气管插管，插管成功后实施开胸手术：①MI组在显微镜直视下以5-0手术缝线行前降支近段结扎的方法建立大鼠AMI模型，观察到左心室前壁运动减弱及颜色变白，判断为建模成功；②Sham组手术丝线仅穿过左冠前降支主干而不结扎冠状动脉，其余操作同MI组；③CMD组通过主动脉根部注射月桂酸钠制作微循环障碍模型，开胸后分离大鼠主动脉，并用血管夹夹闭主动脉后，迅速以微量注射器从主动脉根部直接注入0.3 ml（1 g/L）月桂酸钠，之后松开血管夹恢复供血；④MI+CMD组先予主动脉根部注射月桂酸钠，再行前降支近段结扎。4组术毕均予胸腔内注入少量甲硝唑预防感染及减轻胸腔内粘连。术后4组大鼠均予室内饲养、规律照明、自由进食及饮水，继续饲养4周。造模过程中如出现死亡大鼠以前述方法补充。

3.UCG检测

饲养4周后，再次使用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，通过UCG行心脏超声检查，评价指标包括：①左心室舒张末期容积（LVEDD）与左心室收缩末期容积（LVESD）；②运用单平面Simpson法，超声诊断仪自动得出LVEF与短轴缩短率（LVFS）。

4.组织病理学检查

超声检查后，予戊巴比妥钠过量麻醉处死各组大鼠，取出心脏，用4%多聚甲醛浸泡固定、石蜡包埋、切片。行苏木素-伊红染色、Masson染色，显微镜下观察心肌纤维病理形态学变化，统计正常形态心肌细胞面积比、胶原纤维染色阳性面积比。

5.免疫组化

取4组大鼠左心室心肌组织，常规4%多聚甲醛固定后，石蜡切片常规脱蜡至水，柠檬酸抗原修复，内源性过氧化物酶阻断，顺序加入一抗、二抗，二氨联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水、透明、封片、镜检。采用Leica显微镜采集图像，镜下200倍观察，采集10个视野，并使用NIS-Element 3.0软件进行图像分析，统计各组的毛细血管密度（CD31阳性面积）及胶原表达量（CollagenⅠ阳性面积）。

6.Bax、Bcl-2蛋白表达水平的检测

取各组新鲜大鼠左心室心肌组织，提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）比色法进行蛋白定量；配置10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白，蛋白样品100℃煮沸，等量蛋白样品行SDS-PAGE电泳，转印至聚偏氟乙烯膜上，予Bax 、Bcl-2一抗及辣根过氧化物酶标记二抗孵育，增强化学发光法显色，曝光后扫描，用Image J图像分析软件对曝光后的蛋白条带进行统计分析，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的灰度值作为对照，计算Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平。

四、统计学处理

采用SPSS 18.0分析数据。计量资料以±s表示，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果

一、 4组大鼠的UCG指标比较

与Sham组大鼠比较，MI组大鼠的LVEDD和LVESD均升高，而LVEF下降（P均<0.05），提示心力衰竭模型构建成功。与Sham组相比，CMD组的LVEDD与LVESD也有所升高，EF值下降（P均<0.05），而MI+CMD组较MI组或CMD组，LVEDD与LVESD均进一步升高，EF及FS呈进行性下降（P均<0.05），见表1。

二、 4组大鼠的心肌组织病理学形态比较

1. 苏木素-伊红染色结果

光镜下，Sham组大鼠心肌细胞排列整齐、结构清晰，细胞外间质较少，显示正常的心肌细胞形态。MI组及CMD组与Sham组相比，心肌纤维排列明显紊乱，心肌细胞间隙增宽，间质可见纤维化；而MI+CMD组与MI组比较，心肌纤维更加紊乱，间质纤维化程度更加严重。定量分析显示，MI组、CMD、MI+CMD组正常形态心肌细胞面积比均低于Sham组，其中MI+CMD组的正常形态心肌细胞面积比最低（P均<0.05），见图1。

2.Masson染色結果

Masson 染色正常的心肌组织被染成红色，胶原纤维被染成蓝色。Sham组胶原纤维较少，而MI组、CMD、MI+CMD组心肌蓝染的胶原纤维较Sham组表达量明显增多，其中MI+CMD组胶原纤维程度最高（P均<0.05），见图2。

三、4组大鼠心肌组织CD31和Collagen I免疫组化表达结果比较

与Sham组相比，MI组、CMD组、MI+CMD组心肌组织中Collagen I阳性面积比升高（P均<0.05），而MI+CMD组中Collagen I阳性面积比最高，见图3。与Collagen I阳性面积比相反，与Sham组相比，其余3组的CD31阳性面积比明显降低，而MI+CMD组的CD31阳性面积比最低（P均<0.05），见图4。

5讨论

现有研究显示，部分MI患者即使经过完全血运重建治疗，仍然有反复心绞痛发生，最主要的原因可能是冠状动脉微循环发生障碍，导致心肌细胞水平的灌注不充分，继而出现心脏结构和功能的改变，影响预后[3]。这揭示探讨CMD与心肌梗死后不良心室重构之间的病理生理机制，对制定冠心病的治疗策略有重要意义。

冠状动脉微循环系统不仅是心肌组织细胞营养交换的部位，同时也负责心肌细胞的营养供应及代谢产物清除。近年研究发现，CMD可导致心肌细胞的缺血、坏死及梗死面积增加、心功能下降[4]。随着研究的深入，人们逐渐认识到导致心功能下降的基本机制就是心室重构。研究表明，心肌梗死后心室重构的程度依赖于心肌缺血程度或心肌梗死面积和修复治疗[5-7]。前者提示冠状动脉微循环损伤程度越重或心肌梗死面积越大对心脏结构、功能的损害越明显，后者提示心肌梗死后多种机制或因素参与了心室重构的发生、发展[8]。心室重构包括心肌实质重构和心肌间质重构，后者主要指的是破坏了心肌间质纤维胶原的合成以及降解之间的动态平衡[9]。心室重构的发病机制复杂，主要机制包括细胞外基质和胶原蛋白的异常增多和过度沉积、心肌细胞的凋亡、相关基因表达异常等。本研究中，与Sham组相比，其余3组发生了LVEDD扩大，LVEF下降的变化；而MI+CMD组与MI组或CMD组相比，表现出更为严重的左心室重构及LVEF的下降，提示微循环障碍对于左心室重构起促进作用。研究表明，越多的心肌细胞凋亡，必将导致越多的胶原沉积以填充缺失的心肌细胞[10]。Bcl-2基因为调亡抑制基因，Bax基因为促凋亡基因。本研究显示，MI+CMD组显示出更高的Bax蛋白表达水平，而Bcl-2蛋白表达水平最低，提示合并微循环障碍可比单纯前降支结扎导致更多的心肌细胞凋亡。

另有研究显示，心肌梗死发生后大量的心肌细胞由于缺血、缺氧而发生坏死、凋亡，心肌细胞的增殖能力弱，从而激活增殖成纤维细胞，分泌大量胶原等细胞外基质填充缺失的心肌细胞[11]。CD31是最常用的评估组织血管新生的标志物。多项研究显示，AMI后新生血管的增多可以减少及防止对心脏的二次损害，给即将缺氧的单核细胞提供更充分的血供，并缩短促炎反应以及减轻不良的重构[12-13]。本研究的免疫组化结果显示，与Sham组比较，其余3组梗死心肌区域均出现CD31阳性面积比减少，Collagen I阳性面积比增多，而MI+CMD组的CD31阳性面积比减少更加明显，苏木素-伊红染色和Masson染色也同样提示MI+CMD组心肌纤维化程度尤为严重，说明在心肌梗死过程中，微循环障碍加重了心肌纤维化的进程，从而导致了心室重构的演变以及心功能的恶化。

综上所述，本研究明确了微循环障碍对心肌梗死后左心室重构的调控作用，其加重左心室重构可能的机制包括诱导心肌细胞的凋亡，加重心肌胶原沉积，促进心肌纤维化进展。对于心肌梗死患者，如何保护其微循环障碍可能与单纯开通心外膜血管同样重要。

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（收稿日期：2017-07-28）

（本文编辑：林燕薇）