李果实生长发育过程中糖酸和花青苷含量的变化及相关分析

李鹏 黄晓慧 王克磊 巫伟峰 李斌奇 杨芮 陈发兴

摘 要 以‘黑珍珠李为试材，测定其色泽参数及其发育过程中的糖酸种类与含量、花青苷的种类与含量，并进行花青苷含量与色泽参数的相关性分析、花青苷含量与糖酸含量的通径分析。结果表明：果实中检测到6种有机酸。苹果酸含量最高，其次是顺乌头酸、莽草酸、柠檬酸、琥珀酸和富马酸。果实中葡萄糖和果糖含量变化不大，山梨醇含量相对较低，蔗糖含量随着果实发育逐渐升高。黑珍珠李中主要有矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，果实发育前期果皮和果肉花青苷含量相差不大，而从花后（DAF）85 d开始，果皮花青苷含量急剧增加，此时色泽参数也有相应变化，但果肉花青苷含量与色差变化不大。相关性分析发现，李果皮发育过程中，花青苷含量与L*和b*成负相关，与a*成正相关，果肉花青苷含量与色泽参数相关性不大；通径分析表明，果皮中苹果酸通过其他糖酸对总花青苷的影响较大，果肉中琥珀酸对于其他5个酸起着较大的贡献，而顺乌头酸起着负作用，葡萄糖对于其他3个糖在花青苷的合成上也起着负作用。

关键词 李；有机酸；可溶性糖；色差；花青苷；通径分析

中图分类号 S662.3 文献标识码 A

Abstract Based on‘Heizhenzhu， the color parameters， development process of sugar and organic acid type， content and kinds of anthocyanin were assayed， and the correlation analysis of anthocyanin content and color parameters， and the path analysis of sugar and organic acid were analyzed. The results showed that six kinds of organic acid were detected， and the content of malic acid was the highest， followed by cis-aconitic acid， shikimic acid， citric acid， succinic acid and fumaric acid. The content of glucose and fructose was relatively stable while that of sucrose increased gradually with fruit development. Cyaniding-3-glucoside and cyaniding-3-rutinoside were the main anthocyanin， and at the prophase of fruit development， the content of anthocyanin in peel and fresh was different. But 85 days after full bloom， the content of anthocyanin of peel increased sharply. At this time， the color parameters also had the corresponding change， but the content of anthocyanin and color parameters of the fresh did not changed. Correlation analysis showed that the content of anthocyanin was negatively correlated with L* and b*， and was positively correlated with a*， and the content of anthocyanin in fresh was not correlated with the color parameters； Path analysis showed that malic acid in peel by other sugars and organic acids effects on total anthocyanin larger， succinate acid in the fresh for the other five organic acid played a greater contribution， and cis-aconitic acid played a negative role， glucose for the other three sugars in total anthocyanin synthesis also played a negative role.

Key words Plum； organic acid； sugar； chromatic aberration； anthocyanin； path analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.02.014

色澤是评价果实质量和商品价值的重要指标，有关果实色泽调控机理的研究也一直为人们所关注[1]。在果实色泽形成过程中，花青苷发挥着重要作用，其种类和分布状况与果实色泽密切相关[2]。李果皮中所含花青苷的种类较多，其中含量最多的花青苷是矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷，还有少量的芍药色素-3-葡萄糖苷和芍药色素-3-芸香糖苷[3]。花青苷的形成同时受到温度、光照等外界环境及糖酸、激素和矿质元素等多种因素的影响[4]。

李果实中的可溶性糖主要为果糖、葡萄糖、蔗糖和山梨醇[5]，其不同发育时期所含可溶性糖的种类并无差异，只是含量有所不同[6]。研究表明，可溶性总糖、果糖、葡萄糖和蔗糖均与花青苷合成呈现不同程度的相关性[7]。李果实中的有机酸主要为苹果酸[8]，还含有少量的柠檬酸、琥珀酸、富马酸、顺乌头酸、莽草酸和酒石酸。有机酸含量是果实风味品质的重要组成因素，一方面调节液泡的pH，影响花青苷的稳定性，另一方面花青苷合成过程中的各种酶需要在一个合适的pH值条件下起催化作用[9]。

本试验选取黑珍珠李为试材，通过对比果肉和果皮在生长发育过程中色差、糖酸和花青苷种类及含量变化的差异，探讨花青苷与色泽参数的相关性及与糖酸含量的通径分析，为深入研究李花青苷合成的调控机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 黑珍珠李采自宁德市古田县李种植基地，自5月16日起，每隔7 d采样1次，随机选择生长一致的树3株，每次于东南西北中取果5个，迅速带回实验室，除了用于色差的测量外，其它进行削皮处理，将果皮和果肉分开，用液氮冷冻，然后放入-80 ℃冰箱，用于后续实验。

乙醇、甲醇、盐酸、N-N-二甲基甲酰氨（DMF）、琥珀酸、酒石酸和柠檬酸（国药集团有限公司）；顺乌头酸[阿法埃莎（天津）化学有限公司]；富马酸、莽草酸、苹果酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、矢车菊素-3-葡萄糖苷和矢车菊素-3-芸香糖苷（美国Sigma公司）；BSTFA+1%TMCS（SUPELCO公司）。

1.1.2 仪器与设备 电子分析天平（BAS224S，Sartorius公司，德国）；全自动色差计（北京辰泰克仪器技术有限公司）；离心机（5810R，Eppendorf公司，德国）；电热恒温水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司）；气质联用仪（美国菲力根 TraceGC/PolarisQ）； HPLC仪器：高效液相色谱仪Waters-1525，1525型高精度二元高壓梯度泵（Waters，美国），2707型自动进样器（Waters，美国），2998光电二极管阵列检测器（Waters，美国），Diamonsil C18（L）5 μ 250×4.6 mm COL柱（Diamonsil，中国），外加保护柱。

1.2 方法

1.2.1 色泽参数测量 果实色泽用色差计测量果实赤道4个点的果皮色差L*，a*，b*，C和h，随后切开果实，随机取3个点测量其果肉色差。L*值表示颜色的亮度，取值范围在0～100之间，100代表白色，0代表黑色；a*代表红绿色度，取值范围为-60～+60，a*取正值时为红色和紫色，负值为绿色和蓝色，绝对值越大则颜色越深；b*值代表黄蓝色度，取值范围也在-60～+60，正值时为黄色，负值时为蓝色，绝对值越大则颜色越深[9]。由a*和b*值可以计算出C和h。其中，C=[（a*）2+（b*）2]1/2表示色泽饱和度，h为色调角。

1.2.2 糖酸的组分和含量测定 （1）李果实有机酸和可溶性糖的提取。有机酸和可溶性糖的提取方法参照Jia等[10]的方法，并有所改良。称取-80 ℃条件下保存的样品果肉2.0 g放入研钵中，用液氮研磨，加入5 mL提取液（80%的乙醇溶液），37 ℃水浴加热30 min，超声波提取15 min，离心（4 ℃，10 000 g，15 min），将上清液转到25 mL容量瓶中，重复提取3次，定容。

（2）有机酸和可溶性糖含量的测定。取100 μL提取液于色谱瓶中，真空干燥后先加入50 μL DMF，然后再加入50 μL BSTFA+1%TMCS，在60 ℃下反应30 min，即可进行上样分析[11]。

气相色谱（GC）条件：VF-5ms 30 m×0.25 mm×0.25 μm；程序升温，起始温度70 ℃，保持5.0 min，以5 ℃/min的速度升温至310 ℃，保持1 min；进样口温度230 ℃，不分流进样，载气为氦气，恒流，1 mL/min。

质谱（MS）条件：质谱接口温度为250 ℃，离子源温度220 ℃，电离方式EI，离子能量70 ev，全扫描模式，扫描质量范围为50～600 mu；溶剂切除时间8 min。

1.2.3 花青苷的组分和含量测定 李果实花青苷的提取。取李果实样品用液氮研磨成粉末，称取1.0 g样品，溶解于10 mL的HCl/甲醇（0.25 ∶ 99.75，V/V）溶液中，4 ℃黑暗条件下，提取24 h，期间摇动2次。4 ℃下，12 000 r/min离心10 min。取1 000 μL上清液转移至自动进样瓶。检测波长530 nm，柱温40 ℃；流速1.0 mL/min，进样5 μL。梯度洗脱：溶液A（100%甲醇）和溶液B（0.3%磷酸水溶液）。利用溶液A进行梯度洗脱：0 min，17%；12 min，36%；13 min，25%。

1.3 数据分析

采用Excel 2003进行基础数据的整理，利用SPSS 19.0进行相关性分析，相关系数显著性利用Pearson双侧检验的方法进行检验，并进行花青苷含量与有机酸和可溶性糖含量间的通径分析。

2 结果与分析

2.1 果实生长发育过程中色差的变化

在CIE色度空间中，L*值代表果实表面的亮度，一般与果实着色程度和果实表面的光洁度有关。随着李果实生长发育，前期果皮和果肉L*值变化不明显，而从花后85 d，果皮的L*值明显下降（图1），即从53.85下降至19.23，此时花青苷开始积累，果皮颜色则由黄绿色向黑紫色转变，而果肉的L*值变化不明显。在色泽参数中a*被认为是代表果实红绿色度的值，果皮a*值前期稍微有所下降，而到了花后85 d，a*值迅速增大，从-71.99增大至-28.79，果肉a*值变化也不是明显。果皮a*值前期比果肉低一些，而后期明显比果肉高，可见果皮和果肉着色机理存在很大差异。b*值是黄蓝色度参数，随着果实发育，果皮b*值前期稍稍增大，即由24.10增大至25.95，而到了花后85 d由25.95迅速下降至4.13，可能原因是前期叶绿素降解，果皮颜色绿色稍稍变浅，到了着色期时，花青苷开始积累合成[12]，从黄绿色慢慢转变成红色和紫黑色，而果肉整个时期变化不明显。果皮中的C值呈略微上升，然后陡然下降的趋势，而果肉变化平缓。果皮中的h值则呈先上升再下降再上升的趋势，果肉的变化趋势为先略微上升，再趋于平缓。

2.2 果实生长发育过程中糖酸的变化

2.2.1 果实生长发育过程中有机酸含量的变化 由图2可知，果皮中的总有机酸在花后92 d达到最高值12 700 mg/kg，然后又有所下降，达到9 930 mg/kg，而果肉中的总有机酸维持在6 000 mg/kg。果皮和果肉的苹果酸含量相差较大，且果皮含量多于果肉含量，果皮中的苹果酸前期变化平缓，随后有所上升，花后92 d达到最高值12 700 mg/kg，然后有所下降，花后99 d时达到9 930 mg/kg，而果肉中苹果酸含量整体变化平缓，维持在6 000 mg/kg。果肉的柠檬酸整体呈下降趋势，花后99 d达到最低值49.90 mg/kg，而果皮中的柠檬酸含量先呈下降趋势，花后76 d达到126.12 mg/kg，随后有所上升，花后92 d达到163.63 mg/kg，最后呈下降趋势，于花后99 d达到最低值92.6 mg/kg。果皮和果肉中的顺乌头酸前期都呈下降趋势，且果皮下降量110.41 mg/kg大于果肉下降量34.78 mg/kg，花后85 d，果皮中的顺乌头酸稍微有所上升，花后99 d时，达到最高值199.57 mg/kg，果肉中的顺乌头酸则急剧下降，花后99 d达到最低值89.15 mg/kg，可能是果皮和果肉中顺乌头酸相互转移造成。果肉中的莽草酸含量远远大于果皮中的莽草酸，果皮中的莽草酸在整个发育过程中呈下降趋势，而果肉中的莽草酸含量在花后92 d达到最低值66.63 mg/kg，然后有所上升，达到85.51 mg/kg。果皮和果肉中的琥珀酸和富马酸在发育前期呈上升趋势，花后76 d达到最高值，分别为82.02、84.04 mg/kg和110.88、88.02 mg/kg。随后呈下降趋势，琥珀酸中果皮和果肉含量相差不大，在花后99 d达到最低值15.93 mg/kg和17.06 mg/kg。果皮和果肉中的富马酸也呈下降趋势，果皮中的富马酸在花后99 d达到最低值37.64 mg/kg，而果肉中的富马酸在花后92 d达到最低值17.17 mg/kg，随后有所上升，在花后99 d升至25.40 mg/kg。

2.2.2 果实生长发育过程中可溶性糖含量的变化

由图3可知，果皮和果肉的总可溶性糖变化趋势大致相同，花后92 d达到最高值38.38和23.52 mg/g，然后略微有些下降，达到37 726和23 184 mg/kg。果皮和果肉中葡萄糖、果糖和山梨醇变化都呈平缓趋势，分别维持在9 800、9 300、8 600和6 500、5 500、5 000 mg/kg。果皮和果肉中的蔗糖在整个生长发育过程中呈上升趋势，且果皮中的蔗糖增加量（5 280 mg/kg）于果肉中的蔗糖增加量（2 420 mg/kg），分別为10 175和6 368 mg/kg。

2.3 果实生长发育过程中花青苷含量的变化

由图4可知，在果实发育前期果皮和果肉中的花青苷含量变化平缓，而到了花后85 d时，果皮中的Cy-3-glu和Cy-3-rut含量陡然上升，达26.70和11.39 mg/hg，果肉中花青苷含量的变化平缓。果皮中的总花青苷从花后85 d开始积累，于花后99 d达到最高值38.09 mg/hg，而果肉中的总花青苷变化平缓。

2.4 花青苷含量与色差的相关性

黑珍珠李发育过程中花青苷含量与色泽参数的相关性见表1。由表1可知，果皮中的花青苷与L*值、 b*值和C值相关性显著，呈负相关且相关系数大，其中，Cy-3-glu含量与b*值在 0.97以上，而与a*值呈正相关，Cy-3-glu含量与a*值相关系数也在0.97以上。果肉与色泽参数相关性不明显。

2.5 花青苷含量与糖酸含量的通径分析

以总花青苷含量为因变量，以琥珀酸、富马酸、顺乌头酸、莽草酸、柠檬酸、苹果酸、葡萄糖、果糖、山梨醇和蔗糖为自变量进行通径分析，把各糖酸含量与总花青苷含量的相关系数分解为直接作用和间接作用，以明确不同糖酸含量对总花青的效应大小。

在果皮有机酸和总花青苷的通径分析中（表2），琥珀酸和莽草酸含量与总花青苷含量呈极显著相关，相关系数分别为-0.773和0.882，富马酸含量与总花青苷含量呈显著相关，相关系数为-0.523。相关性分析结果表明，随着果皮花青苷含量的增加，琥珀酸和富马酸含量相应下降，而莽草酸则相应增加。而莽草酸含量对总花青苷含量的直接通径系数最大（p=0.883），与相关系数相近，说明莽草酸含量通过其他糖酸的间接作用很小。苹果酸含量对总花青苷含量的直接通径系数最小（p=-0.532），而与总花青苷含量的相关系数为-0.003，差异性不显著，说明苹果酸通过其他糖酸对总花青苷的影响较大，苹果酸通过莽草酸和山梨醇的间接通径系数分别为0.183和0.252，表明莽草酸和山梨醇在苹果酸对总花青苷含量的增加起着重要贡献。琥珀酸、富马酸和顺乌头酸通过莽草酸对总花青苷的间接通径系数都为负值，分别为-0.580、-0.475和-0.340，表明莽草酸在对其他有机酸的下降起着重要贡献。

而果皮中葡萄糖、果糖、山梨醇和蔗糖含量与总花青苷含量呈正相关（见表2），其中蔗糖与总花青呈极显著相关，相关系数为0.717，即随着蔗糖含量的增加，果皮的花青苷含量也相应增加。山梨醇含量与与总花青苷含量的直接通径系数最大（p=0.291），但相关系数只有0.026，差异不显著，表明山梨醇含量对总花青苷含量的增加有贡献，但通过苹果酸对总花青苷含量的间接通径系数为-0.460，说明在山梨醇对总花青苷的影响中，苹果酸起着抑制的作用。而在葡萄糖、果糖和蔗糖通过苹果酸对总花青苷的间接通径系数为负值，分别为-0.472、-0.344和-0.284，表明苹果酸在可溶性糖对总花青苷含量起着负作用。

果肉与总花青苷的通径分析与果皮有很大差异（见表3），有机酸和总花青苷含量相关性不显著，且呈负相关。琥珀酸和莽草酸对总花青含量的直接通径系数最大，分别为1.186和0.565，而富马酸和顺乌头酸对总花青苷含量的直接通径系数最小，分别为-0.678和-1.242。富马酸、顺乌头酸、莽草酸、柠檬酸和苹果酸通过琥珀酸对果肉总花青苷的间接通径系数较大，分别为1.061、0.805、0.652、0.700和0.620，表明琥珀酸对于其他5个酸在总花青苷合成上有着较大的贡献。而琥珀酸、富马酸、莽草酸、柠檬酸和苹果酸对果肉的总花青苷的间接通径系数较小，分别为-0.843、-0.722、-0.810、-1.081和-0.164，表明顺乌头酸对于其他5个酸在总花青苷合成有着较大的负作用。

果肉中山梨醇含量与总花青苷含量呈极显著正相关，相关系数为0.696，且山梨醇对总花青含量的直接通径系数最大（p=0.696），而葡萄糖对总花青苷的直接通径系数最小（p=-3.237）。果糖、山梨醇和蔗糖通过葡萄糖对总花青苷含量的间接通径系数均为负值，分别为-2.755、-2.800和-2.418，说明葡萄糖在间接作用对于另外3个糖起着负的作用。

果实中总有机酸和总可溶性糖与总花青苷的通径图如图5所示，果皮中总可溶性糖含量对总花青苷含量的直接通径系数为1.198，比上果肉总可溶性糖对总花青苷的直接通径系数0.620大，而果皮中总有机酸对总花青苷的直接通径系数（p=-0.959）比果肉的（p=-0.25）小，一方面表明可溶性糖对于花青苷的合成有着较大的贡献，而有机酸对于花青苷的合成起着负作用，另一方面由于果皮和果肉数据上的差异，表明可能是因为果皮和果肉所处的微琙环境不同造成了糖酸和花青苷有着较大的差异，譬如光照和温度等。

3 讨论

‘黑珍珠李生长发育过程中，大部分有机酸呈下降趋势，但最主要的有机酸苹果酸变化并不明显，呈平缓的趋势；葡萄糖和果糖、山梨醇变化平缓；蔗糖呈上升趋势。花青苷含量与色泽参数相关性分析表明，果皮在生长发育过程中，花青苷含量L*值和b*值成负相关，与a*值成正相关，这一点与前人研究结果一致[13-14]。

另外，李果实生长发育过程中花青苷含量与糖酸含量的通径分析表明，果皮中苹果酸通过其他糖酸对总花青苷的影响较大，果肉中琥珀酸对于其他5个酸起着较大贡献，而顺乌头酸起着负作用，葡萄糖对于其他另外3个糖在花青苷的合成上也起着负作用。李果实总有机酸和总可溶性糖对总花青苷的通径图上表明，总可溶性糖在总花青苷的合成上起着较大的贡献，而总有机酸起着负作用，且果皮变化比果肉明显。崔艳涛[15]、张茜等[16]和张义等[17]也有类似的研究报道，但不同果实存在基因型差异，而且受其他外界因素，譬如激素、光照和温度影响也非常大。

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