广西家蚕核型多角体病毒株gp64基因克隆与序列分析

陈朝蓉　屈达才　朱方容　李俊　闭立辉　梁湘

摘要：【目的】了解广西家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）毒株gp64基因的保守性，并掌握其具体的突变位点，为研究核型多角体病毒（NPV）种内的微进化模式提供参考依据。【方法】对广西不同桑蚕产区的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆与测序，分析完整开放阅读框（ORF）序列的同源性和单核苷酸多态性，并构建基于gp64基因的遗传进化树。【结果】广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列不一致，存在1590、1593和1599 nt三种类型，是由于第94～96位缺失GCG或第97～102位插入GCGCCG所致，且插入核苷酸突变仅在广西BmNPV毒株中出现。仅GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%，其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%～99.2%，其推导氨基酸序列同源性在98.7%～99.6%。19株广西BmNPV毒株被分为两个亚群（clade Ⅰ和clade Ⅱ），其中11株独立形成clade Ⅱ，7株独立形成clade Ⅰ中的一个亚群；广西毒株在多个位点出现同义核苷酸突变，呈一定的规律性。【结论】广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性，在遗传进化上较独立，插入突变显示出地域特点。

关键词： 家蚕核型多角体病毒（BmNPV）；gp64基因；克隆；序列分析；微进化；广西

中图分类号： S884.51 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2017）02-0328-08

Abstract：【Objective】This research aimed to understand gp64 gene conservation of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV） Guangxi isolates and master the specific site of mutation， which could provide reference for study of intraspecific microevolution pattern of nucleopolyhedrovirus（NPV）. 【Method】The gp64 genes of 19 BmNPV strains collected from different sericultural areas in Guangxi were cloned and sequenced. Homology and the mononucleotide polymorphisms of gp64 complete open reading frame（ORF） were analyzed， and phylogenetic tree of gp64 gene was established. 【Result】The gp64 gene ORF sequences of Guangxi BmNPV strains were not consistent， showing three types as 1590 nt， 1593 nt and 1599 nt. The diversities were caused by GCG deletion in position 94-96， and GCGCCG insertion in position 97-102. insertion mutations of nucleotide only happened in Guangxi BmNPV strains. Only GXSL strain shared 100.0% homologies in nucleotide and deduced amino acid sequence with T3 strain. The other 18 strains shared 98.5%-99.2% homology in nucleotide sequence and 98.7%-99.6% homology in deduced amino acid sequence with T3 strain. All 19 Guangxi BmNPV strains were separated into two clades（clade Ⅰand clade Ⅱ）. Among them， 11 strains were included in clade Ⅱ separately and 7 strains were included in a sub-clade of clade Ⅰ. Synonymous substitutions occurred in several positions of gp64 genes from Guangxi BmNPV strains， showing certain regularity. 【Conclusion】The gp64 genes of Guangxi BmNPV strains embodies genetic diversity and independent genetic evolution. The insertion mutation indicates territorial characteristic.

Key words： Bombyx mori nucleopolyhedrovirus（BmNPV）； gp64 gene； clone； sequence analysis； microevolution； Guangxi

0 引言

【研究意义】家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是杆状病毒科鳞翅目特异核型多角体病毒属（α-NPV）成员之一，其病毒粒子呈杆状，外包被有囊膜（King et al.，2011）。BmNPV基因组为大型环状超螺旋的双链DNA分子，最早测序的日本T3毒株基因组超过128 kb，包含136个预测编码蛋白大于60个氨基酸的开放阅读框（ORF）；其中第105个ORF为gp64基因，起止位点为99864～101436，编码530个氨基酸，与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）具有95%的相似性（Gomi et al.，1999）。BmNPV的gp64基因在病毒感染早期和晚期均能转录表达，感染早期转录起始于一个共有的CAGT基序，感染晚期转录则由3个保守的TAAG基序引发，家蚕卵巢细胞感染后6 h即可检测到少量的BmNPV 囊膜糖蛋白（GP64），大量表达始于感染后12 h，并在随后的感染过程一直持续表达；AcMNPV GP64蛋白于感染后6～36 h在Sf21细胞中大量表达，但从感染后48 h起表达量骤减（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003）。BmNPV是家蚕血液型脓病的病原，该病毒传染性强、致死率高，且目前尚无有效的治疗方法，给蚕茧生产带来巨大经济损失。gp64基因是BmNPV重要的结构蛋白基因，深入了解其遗传多样性，对开展BmNPV的致病性、进化模式研究及家蚕血液型脓病防控均具有重要意义。【前人研究进展】核型多角体病毒（NPV）在复制过程中产生两种类型的病毒粒子，即出芽型病毒（BV）和包埋型病毒（ODV）。二者的基因型相同，但表型不同，因此在组织感染特异性和入侵宿主细胞途径等方面存在差异。其中，ODV造成宿主中肠柱状上皮细胞原发性感染，对病毒在宿主个体间的传播起主要作用；BV则造成体内其他细胞的继发性感染，主要负责病毒在宿主细胞间的传播。这些差异可能与病毒囊膜的形态结构和化学成分不同有关（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003；Slack and Lawrence，2005；Sparks et al.，2011）。NPV gp64基因编码BV所特有的GP64蛋白。GP64蛋白结构可分为信号肽区、胞外區、跨膜区和胞内区，经加工修饰的成熟蛋白在信号肽引导下锚定于细胞膜表面，病毒核衣壳通过细胞膜出芽获得该蛋白，形成表面的嵌突结构。GP64蛋白在病毒入侵方面发挥着重要作用，不仅参与对宿主细胞受体的识别和吸附（Hefferon et al.，1999；Zhou and Blissard，2008），还介导病毒囊膜与内吞体膜融合而释放病毒核衣壳（Blissard and Wenz，1992；Monsma and Blissard，1995）。GP64蛋白还与病毒的宿主域有关（Katou et al.，2006；Xu et al.，2012），如BmNPV GP64蛋白的糖基化修饰被抑制后，其蛋白膜融合活性降低，具有传染性的BV产量减少（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003）。此外，有研究表明体外合成与gp64基因相对应的dsRNA能抑制BmNPV在BmN细胞中的表达和增殖（夏定国等，2007）。【本研究切入点】目前，有关BmNPV流行毒株gp64基因的序列信息不多，对该基因的保守性和变异程度了解较少。不同BmNPV毒株的gp64基因ORF存在明显差异，王运湘等（2000）所测毒株的gp64基因ORF为1530 nt，编码509个氨基酸；印度毒株BmNPV-BGL为1539 nt，编码512个氨基酸（Masmudur Rahman and Gopinathan，2003）；T3、Zhejiang、India和Guangxi毒株为1593 nt，编码530个氨基酸；Cubic毒株为1590 nt，编码529个氨基酸（Xu et al.，2013）。这种差异是否对蛋白的功能产生影响，是否与病毒的致病性有关，是否普遍存在于不同BmNPV毒株中，均有待进一步探究证实。【拟解决的关键问题】对广西不同桑蚕产区来源的19株BmNPV毒株进行gp64基因克隆和测序，分析其序列的同源性和单核苷酸多态性，构建遗传进化树，旨在了解广西BmNPV毒株gp64基因的保守性，并掌握其具体的突变位点，为研究NPV种内的微进化模式提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

19株BmNPV毒株从广西不同桑蚕产区采集，保存于广西大学农学院，采集地点及其gp64基因GenBank登录号分别为：GXSL（上林，KX359332）、GXHX（横县，KX359320）、GXDA（都安，KX359316）、GXLJ（柳江，KX359323）、GXLiuC（柳城，KX359322）、GXRS（融水，KX359330）、GXNM（宁明，KX359325）、GXBB（八步，KX359315）、GXRX（容县，KX359331）、GXLingY（凌云，KX359321）、GXNP（那坡，KX359326）、GXTL（田林，KX359333）、GXLS（灵山，KX359324）、GXPB（浦北，KX359327）、GXHS（合山，KX359319）、GXGN（港南，KX359318）、GXGB（港北，KX359317）、GXPN（平南，KX359328）和GXQT（覃塘，KX359329）。Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切核酸酶EcoRⅠ和PstⅠ、pMD18-T载体购自TaKaRa公司，DNA纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。

1. 2 BmNPV基因组DNA抽提

将病死蚕置于灭菌研钵中研磨，加入适量无菌超纯水稀释，用3层纱布过滤除去杂质，滤液反复以400和4000 r/min差速离心10 min，提纯病毒多角体。取多角体悬液加入等量的多角体裂解缓冲液（0.2 mol/L Na2CO3+0.32 mol/L NaCl），混匀，室温静置30 min，12000 r/min离心1 min除去杂质和未裂解的多角体，上清液以1 mol/L Tris-HCl调pH至7.0。采用SDS和蛋白酶K法抽提DNA，具体操作参照《分子克隆实验指南》。

1. 3 引物设计与合成

根据GenBank中BmNPV T3毒株gp64基因的序列信息，用Oligo 6.0和Primer 5.0设计针对gp64基因的特异性引物（F：5'-GCCAAATAGCGGTCGGGTAT-3'和R：5'-CGCTTGTGGTATGAGAAACGAAC-3'）。引物由广州华大基因科技股份有限公司合成。

1. 4 目的基因克隆测序

PCR反应体系50.0 μL：10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP混合液（各2.5 μmol/L）5.0 μL，上、下游引物（50 pmol/μL）各2.0 μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，DNA模板2.0 μL，超纯水补足至50.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶进行电泳，胶回收目的片段，与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞DH5α，经蓝白斑筛选，挑取阳性克隆于LB培养基过夜培养，抽提质粒并进行EcoRⅠ/PstⅠ双酶切鉴定。阳性质粒送至广州华大基因科技股份有限公司测序，选择双向测序，测序结果利用MegAlign和EditSeq程序进行剪切与拼接。

1. 5 序列比对分析

选取NCBI上已发表BmNPV及其他NPV的gp64基因完整ORF序列为参考，以BmNPV T3株为标准参考。BmNPV参考毒株分别为：T3（日本，L33180），N9（日本，AB253773），Brazilian（巴西，KJ186100），C1、C2、C6（韩国，KF306215、KF306216、KF306217），Zhejiang（浙江，JQ991008），Cubic（苏州，JQ991009），India（印度，JQ991010），Guangxi（广西，JQ991011）；其他NPV参考毒株分别为：AcMNPV（L22858），RoMNPV（薄荷灰夜蛾核型多角体病毒，AY145471），Boma S1、S2（野桑蚕核型多角体病毒，FJ882854、JQ071499）。以MegAlign程序的ClustalX对参考毒株与广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列进行比对，分别比较核苷酸及其推導氨基酸的同源性，通过MEGA 5.0的Kimura 2-parameter模式构建遗传进化树，分析gp64基因的单核苷酸多态性。

2 结果与分析

2. 1 PCR扩增和酶切鉴定结果

BmNPV T3株gp64基因的ORF为1593 nt，预期扩增广西毒株的目的片段约1700 bp，包含完整的ORF。PCR扩增和酶切鉴定的目的片段大小与预期结果相符（图1）。

2. 2 gp64基因ORF序列测定结果

测序发现，广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列存在差异，有1590、1593和1599 nt三种类型，分别编码529、530和532个氨基酸。其中，GXSL、GXBB、GXDA、GXLS和GXLJ 5株毒株的gp64基因ORF为1593 nt，与标准参考T3毒株的gp64基因ORF相同；GXLingY、GXLiuC、GXNM、GXRS、GXRX、GXNP和GXTL 7株毒株的ORF缺失第94～96位核苷酸（GCG），造成一个丙氨酸的缺失突变；GXGB、GXGN、GXHX、GXHS、GXPB、GXPN和GXQT 7株毒株的ORF在第97～102位6个核苷酸（GCGCCG）插入，造成一个丙氨酸和一个脯氨酸的插入突变；除N9株外，其他BmNPV毒株均比AcMNPV多出序列前端的54个核苷酸，即蛋白N端的18个氨基酸残基（图2）。

2. 3 gp64基因ORF序列比对结果

以T3毒株为标准参考，比对19株广西BmNPV毒株gp64基因ORF的同源性。结果（表1）显示，只有GXSL毒株与T3毒株的核苷酸及其推导氨基酸序列同源性均达100.0%，其余18株毒株与T3毒株的核苷酸序列同源性在98.5%～99.2%，其推导氨基酸序列同源性在98.7%～99.6%，说明广西BmNPV毒株与T3毒株的gp64基因具有较高的同源性。此外，仅GXGB与GXGN、GXLingY与GXNP的gp64基因ORF核苷酸序列完全相同，同源性为100.0%，说明该基因在BmNPV种群内极易发生变异。以AcMNPV、RoMNPV和Boma S2的gp64基因序列为不同种NPV参考，发现广西BmNPV毒株与其核苷酸序列的同源性小于或等于97.0%。Boma S1的gp64基因与所有广西BmNPV毒株的核苷酸序列同源性均大于99.0%，说明广西BmNPV毒株与BmNPV存在较高的同源性。

2. 4 遗传进化树分析结果

为了解广西BmNPV毒株与其他参考毒株的遗传进化关系，根据gp64基因ORF序列构建遗传进化树。结果显示，遗传进化树可分为两大群（图3），所有BmNPV毒株归属于同一群，除Boma S1外的其他NPV归于另一群，说明不同种的NPV在进化上存在一定差异，BmNPV的群外参照成立，分群合理。Cubic是一个能形成四方形多角体的BmNPV毒株，除此之外，其余BmNPV毒株被分为3个亚群（clade Ⅰ、clade Ⅱ和clade Ⅲ）。19株广西BmNPV毒株被分为2个亚群（clade Ⅰ和clade Ⅱ）。其中，有11株广西BmNPV毒株位于clade Ⅱ，分别为GXGB、GXGN、GXLS、GXPN、GXRS、GSHS、GXQT、GXPB、GXHX、GXLingY和GXNP，形成一个独立的群；另外8株与参考毒株T3、Zhejiang、Guangxi同属于clade Ⅰ，除GXSL外的7株独立形成clade Ⅰ中的一个亚群。clade Ⅲ则由6个BmNPV参考毒株和Boma S1毒株构成。GXGB和GXGN、GXLingY和GXNP分别位于独立的亚群。

2. 5 单核苷酸多态性分析结果

对BmNPV gp64基因ORF进行单核苷酸多态性（SNPs）分析，结果显示，除GXSL毒株与T3毒株的序列完全相同外，其余的广西BmNPV毒株和参考毒株均发生369C、768G、861C、891G和1518T突变，这些突变均为同义突变，核苷酸的替换不引起氨基酸改变；而且这些广西BmNPV毒株和部分参考毒株还发生1395C同义突变和1580C非同义突变，其中1580C突变使得丝氨酸→苏氨酸。除GXSL和GXLS毒株外，所有广西BmNPV毒株均发生839A非同义突变，相应位点的氨基酸由精氨酸→赖氨酸；除GXSL、GXLS、GXRS和GXHX毒株外的广西BmNPV毒株均发生888A同义突变。部分广西BmNPV毒株还发生129A、322A、418G、459T、627A、930G、942T、1290T和1540A突变，其中322A、418G和1540A为非同义突变，而在所有参考毒株中均未出现这3个位点的非同义突变。在24个核苷酸突变位点中，只有5个为非同义突变，氨基酸发生了改变，其余均为同义突变（表2）。广西BmNPV毒株中有部分毒株在第94～96位缺失核苷酸（GCG），部分毒株则在第97～102位插入核苷酸（GCGCCG）（图2）。广西BmNPV毒株在多个位点出现相同的核苷酸突变，呈一定的规律性。

3 讨论

广西BmNPV毒株gp64基因ORF序列存在1590、1593和1599 nt三种类型，是由于第94～96位缺失GCG或第97～102位插入GCGCCG所致，具有遗传多样性。插入核苷酸（GCGCCG）突变仅在广西BmNPV毒株中出现，显示出一定的地域特点。广西BmNPV毒株gp64基因ORF序列突变造成一个丙氨酸缺失或一个丙氨酸和一个脯氨酸插入，两种突变皆位于氨基酸序列的近N端。AcMNPV gp64基因编码512个氨基酸，N端的前20个氨基酸残基构成疏水的膜定位信号肽区（Oomens and Blissard，1999）。通过比对AcMNPV与BmNPV GP64蛋白的氨基酸序列，发现前者缺失N端的18个氨基酸残基，广西BmNPV毒株gp64基因近N端的突变正好位于相应的信号肽区内，而突变的氨基酸皆为疏水性氨基酸，其缺失或插入是否对信号肽区的性质和功能产生影响尚有待进一步探究。

19株广西BmNPV毒株的gp64基因ORF序列中，仅GXSL毒株与标准参考T3毒株的核苷酸序列同源性达100.0%，其余毒株在98.5%～99.2%。这些毒株的多角体蛋白基因polh与T3毒株的相比，其同源性均超过99.5%（Liang et al.， 2013），说明gp64基因的保守性不如polh基因。GXGB與GXGN、GXLingY与GXNP比较，gp64基因ORF核苷酸序列同源性均为100.0%，且遗传进化树结果显示分别位于独立的亚群；但其polh基因核苷酸序列同源性同为99.9%，p10基因同源性同为100.0%（Liang et al.，2013）。此外，GXGB与GXGN、GXLingY与GXNP毒株的来源地彼此靠近，故推测可能为同一毒株。BmNPV的多角体可在环境中长期保持感染性，通过贸易、交通等人为因素及风雨等自然因素的作用，进行远距离扩散传播（Fuxa，2004）。广西BmNPV毒株与种外参考毒株Boma S1比较，其gp64基因同源性大于99.0%。Xu等（2010）通过对比Boma S1与BmNPV T3的gp64基因，发现其氨基酸序列同源性为99.8%，但Boma S1对家蚕的感染性较低。

本研究构建的遗传进化树显示，所有BmNPV毒株归于一群，除Boma S1外的其他NPV毒株归于另一群。虽然BmNPV与AcMNPV、RoMNPV、Boma S2的gp64基因核苷酸同源性较高（高于93.0%），但在遗传进化上仍存在一定距离。除Cubic毒株外，其余BmNPV毒株被分为3个亚群，其中11个广西BmNPV毒株独立形成clade Ⅱ，其中包括7株在第97～102位插入6个核苷酸的毒株。在clade Ⅰ中除GXSL毒株外，其余7个广西BmNPV毒株独立形成一个亚群，提示广西BmNPV毒株在遗传进化上呈一定的独特性。基于NPV核心基因构建的系统发育进化树可知，其分类与宿主的分类一致，提示NPV与宿主间存在共同进化的关系（Herniou et al.，2004）。由于宿主家蚕为经济昆虫，人工饲养过程中采取的防病措施及抗病品种的使用，导致BmNPV面临的选择压力比自然界其他NPV种群大，因此其进化速度有可能更快。

广西BmNPV毒株gp64基因在多个位点出现核苷酸突变，除GXSL外的广西BmNPV毒株和参考毒株均发生369C、768G、861C、891G和1518T突变。此外，广西BmNPV毒株均发生1395C同义突变和1580C非同义突变；部分广西BmNPV毒株还发生129A、322A、418G、459T、627A、930G、942T、

1290T和1540A突變。在24个核苷酸突变位点中，只有5个为非同义突变，其余均为同义替换，即编码氨基酸简并密码的最后一位发生改变。同种NPV不同毒株间的基因型和表型差异，表明NPV存在微进化（Herniou and Jehle，2007），保持遗传多样性以应对自然选择和适应不同的环境条件，但目前对NPV种群微进化的了解有限。BmNPV种群基因组中编码氨基酸的密码子多样化，也可能是微进化的一种方式，以便于更好地利用宿主代谢系统进行繁衍，并有可能逃避宿主免疫系统的识别。

4 结论

广西BmNPV毒株的gp64基因具有遗传多样性，插入突变显示出地域特点，在遗传进化上较独立。该结论可为BmNPV gp64基因结构和功能的探索打下基础，同时为NPV种内的微进化模式研究提供参考依据。

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（責任编辑 兰宗宝）