牛乳中产色葡萄球菌的分离与鉴定

费育超 倪宏波

摘要 [目的]确定送检的患乳房炎病牛乳汁中是否有产色葡萄球菌感染。[方法]从患乳房炎病牛乳汁中分离致病菌，并对其进行鉴定，最后通过药敏试验筛选出对其敏感的药物。[结果]分离菌16S rRNA基因片段为长度1 422 bp的核苷酸序列。经BLAST分析可知，其与产色葡萄球菌16S rRNA核苷酸序列相似性高达99%，确定其为产色葡萄球菌。药敏试验结果表明，产色葡萄球菌对环丙沙星和四环素高度敏感，而对多黏菌素-B、青霉素、克林霉素和诺氟沙星等不敏感。[结论]研究结果可为确定乳房炎的病原及治疗方法提供新思路。

关键词 奶牛乳房炎；16S rRNA；产色葡萄球菌；耐药性分析

中图分类号 S852.61 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）25-0120-02

Abstract [Objective]To check whether there was Staphylococcus chromogenes infection in the milk of diseased cattle with mastitis.[Method]Pathogen were isolated and identified from the milk of diseased cattle with mastitis.And the sensitive drugs were screened out by drug susceptibility test.[Result] 16S rRNA gene fragment of the isolated bacteria was a nucleotide sequence with the length of 1 422 bp.BLAST analysis showed that its similarity with Staphylococcus chromogenes 16S rRNA nucleotide sequence was up to 99%，so it was confirmed as Staphylococcus chromogenes.Drug sensitivity test showed that it was highly sensitive to ciprofloxacin and tetracycline，and it was tolerant to polymyxinB，penicillin，clindamycin and norfloxacin and others.[Conclusion]The research results can provide new ideas for studying the pathogen and treatment methods of mastitis.

Key words Cow mastitis；16S rRNA；Staphylococcus chromogenes；Drug tolerance analysis

奶牛乳房炎是对乳品业危害最严重的疾病之一[1]。葡萄球菌是奶牛乳房炎发生的主要致病菌，分为凝固酶阳性葡萄球菌（Coagulase positive staphylococcus，CPS）和凝固酶阴性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococcus，CNS）。产色葡萄球菌属于CNS，是一种重要的条件性致病菌和免疫损伤时的感染菌，发生感染时往往不表现典型的临床症状，但是当机体抵抗力降低或其进入非正常寄居部位时，可引起多种感染[2]。产色葡萄球菌常常定殖于乳头且易在乳导管内增殖，会导致临床型和隐性型乳房炎，头胎牛比多胎牛更易感，感染后发展成临床型乳房炎。近年来，产色葡萄球菌已成为临床感染的重要病原菌，已经在牛乳[3]、鸡和羊中分离到，并能产生毒素[4-5]，造成危害。随着广谱抗生素的长期不合理使用，葡萄球菌的耐药性日益严重，特别是抗甲氧西林葡萄球菌的出现，多重耐药性的特点使其成为临床疾病治疗上最棘手的问题之一。笔者从患乳房炎病牛乳汁中分离到1株多重耐药的产色葡萄球菌，并对其进行了鉴定，最后通过药敏试验筛选出对其敏感的药物。

1 材料与方法

1.1 病料的采集 黑龙江省大庆市某牛场送检的患乳房炎病牛乳汁。

1.2 培养基、试剂及试验动物 血液琼脂平板培养基、BHI液体培养基、具有氨苄抗性的LB培养基、PCR Master Mix 缓冲液、pMD18-T克隆载体和 DL 2000 Marker，均购自大连宝生物工程有限公司；GenStar 胶回收试剂盒、药敏纸片，购自北京康润誠业生物科技有限公司。雄性昆明系小鼠，体质量22 g，购自牡丹江医学院实验动物中心。

1.3 引物设计

根据GenBank数据库中已发表的链球菌基因序列，设计了1对16S rRNA通用引物[6]，来扩增目的片段。正向引物为5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 细菌分离培养

将奶样离心处理后接种在血液琼脂平板培养基上，置于37 ℃恒温箱中培养24 h，染色并观察菌落形态。对分离菌进行纯培养后，接种于LB液体培养基中，37 ℃下振荡培养20 h，观察其生长情况。

1.5 动物试验 挑取5只健康小鼠，分为试验组与对照组，从试管中取0.5 mL菌液经由皮下注射给试验小鼠，24 h后观察小鼠的情况。

1.6 分离菌核酸的提取及鉴定

1.6.1 组织DNA的提取。

从致病菌液中取500 μL菌液置于1.5 mL离心管中，4 ℃，12 000 r/min离心1 min，弃上清，加入500 μL去离子水悬浮沉淀，4 ℃下12 000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μL去离子水，煮沸5 min，4 ℃，12 000 r/min离心5 min，获得细菌的DNA，-20 ℃下保存备用。

1.6.2 PCR扩增。

以得到的DNA为模板，利用16S通用引物进行PCR扩增，取5 μL的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.7 序列分析

按照GenStar 胶回收试剂盒说明书进行胶回收，然后取500 μL离心管，加入1 μL T载体、4 μL Buffer和5 μL的胶回收提取物，置于4 ℃恒温箱中16 h进行连接并将其转化到大肠杆菌的感受态中。挑取单菌落，接种于LB液体培养基中，置于摇床上，37 ℃下培养24 h， 将菌液分装到2个1.5 mL的离心管中，送到测序公司进行16S rRNA双向测序，并将测序结果在NCBI网站进行BLAST比对，确定致病菌。

1.8 药敏试验与耐药性分析

致病菌接种于血液琼脂培养基后，将药敏纸片分别贴于平皿中，37 ℃下培养24 h，测量抑菌环直径大小，根据检测标准判定结果。

2 结果与分析

2.1 细菌分离结果

菌株在血液琼脂培养基上形成光滑、湿润、乳白色不透明的小菌落，在LB液体培养基中生长较好，试管生成黏性沉淀物，镜检发现该致病菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列 。

2.2 PCR扩增结果 经过PCR扩增，获得1条1 400 bp左右的条带（图1）。

2.3 序列分析结果

通过将菌体的测序结果与GenBank数据库进行Blast对比发现，致病菌与产色葡萄球菌部分序列同源性达到99%，因此可确定该致病菌为产色葡萄球菌。

2.4 药敏试验结果 药敏结果表明，分离菌对环丙沙星和四

环素高度敏感，对链霉素、红霉素、阿米卡星中度敏感，对多黏菌素-B、青霉素、克林霉素和诺氟沙星等不敏感。

3 结论与讨论

基于16S rRNA在鉴定细菌种属的可靠性[7]与其序列高度保守的特点，笔者对致病菌株进行了16S rRNA鉴定，发现与产色葡萄球菌的同源性达到99%，由此确定该致病菌为产色葡萄球菌。

近年来，关于条件性致病菌的报道日益增多，这与饲料中添加抗生素与使用抗生素密切相关。该试验中分离到的产色葡萄球菌是一株多重耐药菌，对环丙沙星和四环素高度敏感，对青霉素和克林霉素等存在耐药性。

产色葡萄球菌是引起奶牛亚临床乳房炎的高流行致病菌，已明确其对体细胞数量产生影响，但有关该菌及抗菌药物敏感性的研究报道不多。卢天舒等[8]研究发现凝固酶阴性葡萄球菌的主要致病机理与溶血素和细菌胞壁外的黏液物质有关，细菌胞壁外的黏液物质在细菌黏附、抗吞噬和抵抗宿主免疫防御机能方面起重要作用。然而，目前产色葡萄球菌的致病机理尚不明确。笔者从患乳房炎病牛乳汁中分离致病菌，经鉴定确定为产色葡萄球菌，可为确定乳房炎的病原及治疗方法提供新思路。

参考文献

[1]DEMELASH B，ETANA D，FEKADU B.Prevalence and risk factors of mastitis in lactating dairy cows in southern ethiopia[J].Appl Res Vet Med，2005，3：189-198.

[2] GILLESPIE B E，HEADRICK S I，BOONYAYATRA S，et al.Prevalence and persistence of coagulasenegative Staphylococcus species in three dairy research herds[J].Veterinary microbiology，2009，134（1/2）：65-72.

[3] 趙德军，张碧霞，曹雁，等.乳腺分泌物中检出产色葡萄球菌1例[J].西南军医，2007，9（6）：36.

[4] SAWANT A A，GILLESPIE B E，OLIVE S P，et al.Antimicrobial susceptibility of coagulasenegative Staphylococcus species isolated from bovine milk[J].Veterinary microbiology，2009，134（1/2）：73-81.

[5] LARS O A，PETRENER A，LISE D，et al.Exudative epidermitis in pigs caused by toxigenic Staphylococcus chromogenes[J].Veterinary microbiology，2005，105（3/4）：291-300.

[6] FRANK J A，REICH C I，SHARM S，et al.Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes[J].Appl Enuir Microbiol，2008，74（8）：2461-2470.

[7] 周永运，戎建荣，白雪梅，等.16S rRNA基因序列分析用于诊断病原性细菌感染初步研究[J].中国人兽共患病学报，2006，22（7）：639-642.

[8] 卢天舒，关靖宇，安春丽.凝固酶阴性葡萄球菌临床流行及其耐药性研究现状[J].临床军医杂志，2010，38（3）：451-453.