Folin—Ciocalteu比色法测定头花蓼多酚含量

2017-05-30江楠李潇彬顾曼琦廖莉玲

安徽农业科学 2017年23期

江楠李潇彬顾曼琦廖莉玲

摘要[目的]建立头花蓼中多酚含量的比色测定方法。[方法]以没食子酸为对照品，对测定头花蓼中多酚含量的比色条件（包括检测波长、Na2CO3用量、Folin-Ciocalteu 试剂用量、反应温度及时间对吸光值的影响）进行了研究。[结果]当FC试剂用量为2.5 mL，12% Na2CO3用量为7 mL时，在35 ℃下反应40 min为最佳反应条件；多酚的含量与760 nm 处吸光度呈良好的线性关系；测定方法的平均回收率为98.66%，RSD为0.380%。[结论]该方法不仅操作简单，而且稳定性、重現性、精密度好，能够用于头花蓼提取液多酚含量的测定。

关键词头花蓼；多酚；Folin-Ciocaheu 比色法；检测条件

中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2017）23-0114-02

Determination of Polyphenols in Polygonum capitatum by FolinCiocalteu Colorimetry

JIANG Nan1，LI Xiaobin2，GU Manqi2，LIAO Liling2*

（1.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550025；2.School of Chemistry and Material Science，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550001）

Abstract[Objective] The research aimed to establish a colorimetric method for the determination of polyphenols in Polygonum capitatum. [Method]To gallic acid as a reference substance，the colorimetric conditions （the effects of detection wavelength，Na2CO3 dosage，FolinCiocalteu reagent dosage，reaction temperature and time on the absorbance value） were studied.[Result]When FolinCiocalteu reagent was 2.5 mL and 12% sodium carbonate solution was 7 mL， reaction 40 min at 35 ℃，there was a good linearity between the absorbance and gallic acid concentration in 760 nm，the average recovery was 98.66%and RSD was 0.380%.[Conclusion]This method is simple，accurate，repeatable and stable.It can be used for the determination of polyphenol content in Polygonum capitatum.

Key wordsPolygonum capitatum；Polyphenol；FolinCiocaileu colorimetry；Detecting condition

基金項目贵州省科技厅_2014 年度贵州省科技厅与贵州师范大学联合基金计划项目（黔科合LH字[2014]7064号）。

作者简介江楠（1962—），女，贵州遵义人，副教授，从事食品化学、药物化学方向研究。*通讯作者，教授，硕士，硕士生导师，从事天然产物研究。

收稿日期2017-05-31

头花蓼（Polygonum capitatum）为蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum L.）多年生植物，又名小红要、小红藤等，主要分布在贵州、云南等地，现广泛用于治疗泌尿系统疾病[1] 。目前从头花蓼中分离和鉴定的主要化合物为黄酮类、酚酸类、有机酸、醇、酯、醛类等[2-3]。方炜等[4]用高速逆流色谱法同时分离制备得到头花蓼中没食子酸和原儿茶酸；刘跃等[5]建立了头花蓼药材中没食子酸、原儿茶酸、陆地棉苷、槲皮苷、儿茶素、槲皮素- 3- O- （2″- 没食子酰基）- 鼠李糖苷及槲皮素的 UPLC- MRM- MS 检测方法；李占彬等[6]利用HPLC - MS/MS 同时测定头花蓼中6种酚酸类有效成分。这些检测方法虽然结果精确，但所需要的仪器价格高昂，操作也复杂。Folin-Ciocalteu 比色法由于操作简单、成本低，已广泛用于测定植物中多酚的含量[7-10]。笔者探讨了Folin-Ciocalteu 比色法测定头花蓼总多酚的条件。

1材料与方法

1.1仪器101-1A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），A200S型电子天平（Made in Germany），循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），KDM型控温电热套（山东鄄城华鲁电热仪器有限公司），UV2300分光光度计（上海天美科学仪器有限公司），FZ102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）[7]。

1.2试材头花蓼（施秉三元威门公司），没食子酸标准品（贵州迪大生物科技有限公司），Folin-Ciocalteu （分析纯）。

1.3方法

1.3.1对照品溶液的制备。

精密称取没食子酸0.025 0 g，精确配制成0.025 0 mg/L的没食子酸标准溶液。

1.3.2头花蓼样液制备。

在70 ℃下将2.0 g头花蓼粉末用100 mL水回流提取2次，每次1 h。将提取液稀释于500 mL即得到待测试样。

1.3.3Folin-Ciocalteu 法检测条件。

1.3.3.1比色波长的测定。

分别移取2.0 mL标准液和样品液，加入2.0 mL FC试剂及6.0 mL 12% 的Na2CO3 后稀释至25 mL，30 ℃显色1 h后，在 400～ 900 nm 波长范围内扫描，确定最佳检测波长。

1.3.3.2FC试剂用量的研究。

取1 mL样品液、6 mL 12% Na2CO3 溶液，然后分别加入 0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0 mL的 FC試剂，均定容到25 mL棕色容量瓶中，30 ℃ 下显色 1 h后以试剂空白作参比，在760 nm 下测定吸光度。

1.3.3.3Na2CO3用量的研究。

取1 mL样品液、2.5 mL FC试剂，12% Na2CO3溶液的用量分别为3、4、5、6、7、8 mL，均定容到25 mL棕色容量瓶中，30 ℃ 下显色 1 h后以试剂空白作参比，在760 nm 下测定吸光度。

1.3.3.4显色时间和温度的确定。

取1 mL 样品液、2.5 mL FC试剂、7 mL Na2CO3溶液，均定容至 25 mL棕色容量瓶中。分别在 20、25、30、35、40 ℃下显色10、20、30、40、 50、60 min 后以试剂空白作参比，在 760 nm 下测定吸光度。

1.3.4方法评价

1.3.4.1标准曲线的建立。

分别取没食子酸标准品溶液10、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL棕色容量瓶中，用最适宜的条件显色后测吸光度。以没食子酸浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

1.3.4.2稳定性试验。

分别测定头花蓼样液显色反应完全（40 min）后 0、20、 40、 60、80、100 min 的吸光度，该比色法的稳定性根据吸光度的变化来评价。

1.3.4.3精密度试验。

精密量取头花蓼样液，按照标准曲线的测定方法测定吸光度，重复测定5次，以吸光度分析结果的相对标准偏差（RSD）评价该仪器精密度。

1.3.4.4重现性试验。

同一批头花蓼样品取5份提取样液，按照标准曲线方法进行检测，以吸光度分析结果的RSD评价该比色法的重现性。

1.3.4.5加标回收试验。

分别测定提取液中加入不同量的没食子酸后的多酚含量，并计算其回收率和RSD，以此评价该比色方法的准确度和可靠性。

2结果与分析

2.1比色条件的测定

2.1.1最佳吸收波长。

从图1可以看出，样品液和标准液在760 nm处有最大吸光度，因此确定最佳吸收波长为760 nm。

2.1.2最佳FC试剂用量。

当FC试剂用量为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL时，吸光度分别为0.346、0.384、0.401、0429、0.461、0.460。由此可见，FC试剂用量在0.5～2.0 mL随着用量的增加吸光度也在增加，在2.5 mL时达到最大值，之后吸光度开始稳定，因此选择2.5 mL为最佳用量。

2.1.3最佳Na2CO3用量。

当Na2CO3用量为3、4、5、6、7、8 mL时，吸光度分别为0.414、0.434、0.457、0.461、0.464、0464。由此可见，从7 mL开始吸光度随着Na2CO3用量的增加而稳定开始趋于平缓，因此选择7 mL为最佳用量。

2.1.4最佳显色温度和时间。

从表1 可以看出，温度较低时，显色反应缓慢且吸光度较小；当温度升高时，显色反应加快且吸光度增大；但温度升至40 ℃吸光度反而降低，表明显色温度不能太高。因此选择最佳反应温度和时间为35 ℃、40 min。

2.2比色方法评价

2.2.1标准曲线。以没食子酸溶液浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，

得出线性回归方程y=0.131 3x+0.005 3（R2=0.999 3），线性关系良好，该方程可用于头花蓼多酚的定量测定。

2.2.2稳定性试验。在完全反应后0、20、40、60、80、100 min时的吸光度分别为0466、0.465、0.466、0.464、0.463、0.463，RSD为0.297%。由此可见，溶液在100 min内稳定性良好。

2.2.3精密度試验。溶液重复测定5次的吸光度分别为0464、0.464、0.465、0.464、0.463，RSD为0.152%。表明仪器精密度良好。

2.2.4重复性试验。

同一批头花蓼分别提取5次。5份溶液的吸光度分别为0.466、0.466、0.464、0.464、0.465，RSD为0.215%。表明该方法重复性良好。

2.2.5加标回收试验。由表2可知，4次加标回收率在98.33%～98.98%，平均回收率为98.66%，RSD为0.380%。表明该研究所建立的 Folin-Ciocaheu 检测法准确可靠，完全可用于头花蓼多酚含量的测定。

3结论

（1）该研究采用 Folin-Ciocalteu比色法测头花蓼多酚含量，确定最佳的显色条件为：2.5 mL Folin-Ciocalteu 试剂、7 mL 12% Na2CO3、显色温度35 ℃、显色时间40 min、测定波长760 nm。标准曲线的线性回归方程为y=0.131 3x+0.005 3（R2= 0.999 3）。

（2）该方法的稳定性试验、精密度试验、重现性试验、回收率试验的RSD分别0.297%、 0.152%、0.215%、 0.380%，表明该研究建立起的 Folin-Ciocalteu 法测定头花蓼多酚含量可信、可靠。

参考文献

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