酸性土壤改良剂与生防制剂协同防控香蕉枯萎病的效果

黄建凤 张发宝 逄玉万 黄巧义 付弘婷 李苹 杨苞梅 唐拴虎

摘 要 将酸性土壤改良剂分别与生防制剂结合，通过温室盆栽试验研究其防控香蕉枯萎病的效果。酸性土壤改良剂分别与放线菌菌剂处理（ActA）和生物有机肥处理（BIOA）的协同防效（61.1%和58.3%）均高于单独施用酸性土壤改良剂（ASA）（49.7%）、放线菌菌剂（Act）（55.6%）和生物有机肥（BIO）的处理（52.8%）。至试验结束时，各处理土壤的pH值显著高于对照（CK）（p<0.05）；Act和BIO處理显著降低了香蕉根际尖孢镰刀菌数量（p<0.05）；ActA和BIOA处理能显著提高香蕉根际细菌和放线菌数量并降低真菌数量。各处理显著促进香蕉生长，且能提高土壤有机质、有机碳、全氮、速效钾含量和电导率。结果表明，酸性土壤改良剂和生防制剂可有效协同防控香蕉枯萎病。

关键词 香蕉枯萎病；生物防控；酸性土壤改良剂；生物有机肥；放线菌菌剂

中图分类号 S436.67 文献标识码 A

Abstract Fusarium wilt of banana is a lethality soil-borne disease and it is very important to control the threaten. Biocontrol efficacy on Fusarium wilt of banana was evaluated in this study based on greenhouse condition and physiological and biochemical analyzation， and the biocontrol materials were acid soil ameliorant collaborated with bioorganic fertilizer and actinomycetes agents. The results were listed as follows： treatments of collaborative of acid soil ameliorant and biocontrol materials（ActA and BIOA）showed higher biocontrol efficacy（61.1% and 58.3%）than those of Act（55.6%）and BIO（52.8%）， respectively. The soil pH value of ASA， Act， BIO， ActA and BIOA increased to some degree， and significantly higher than that of CK（5.13）（p<0.05）at the end of experiment（56 days after transplanting）. Application of biocontrol materials could significantly reduce the population of F. oxysporum in banana rhizosphere soil（p<0.05）and the collaborative of acid soil ameliorant strengthened this effect. Treatments ActA and BIOA could also significantly increase bacteria population， while decrease fungi population. Compared with CK， the stem diameter， length and biomass of banana plant in all treatments increased significantly and the organic matter， organic carbon， total nitrogen， available potassium and electric conductivity also increased.

Key words Fusarium wilt of banana； biological control； acid soil ameliorant； bioorganic fertilizer； actinomycetes agents

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.025

香蕉枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp. cubense）又名香蕉巴拿马病和黄叶病，是由古巴尖孢镰刀菌侵染引起的一种由土壤和苗木传播的毁灭性土传真菌病害，该病害的防控已迫在眉睫。目前植物病害的生物防控因其环境友好型等特征已成为研究热点。国内外已有很多研究者筛选到如非致病性尖孢镰刀菌、木霉、放线菌、芽孢杆菌和假单胞菌等有益微生物，这些微生物均表现出一定的生防效果[1-3]。为保障拮抗菌在植株根际定殖，将有机载体与生防菌结合应用是一项有效措施。已报道的载体包括有机液肥、香蕉茎秆和动物粪便堆肥产品、菜粕堆肥和氨基酸有机肥等；与拮抗菌的结合方式有吸附和二次发酵，两种方式获得的产品在防效上存在差异，后者效果更好[4-7]。

长期连作香蕉的土壤易出现土壤酸化严重、植株营养失衡和枯萎病流行严重的现象[8]。有研究表明，连作土壤环境因子中，土壤pH值对尖孢镰刀菌在土壤中增殖的影响非常显著，随着酸化程度的增加，尖孢镰刀菌增殖速率显著增加，因此，土壤酸化可能是造成连作枯萎病高发的重要原因[9-10]。针对蕉园土壤酸化的改良措施已有报道，主要是施用石灰、木薯渣、蔗渣、硝态氮肥、钙、铁、磷矿粉和碱性肥料等，这些措施均表现出一定的防效，其中碱性肥料的应用更是将香蕉枯萎病田间发病率降至18%以下，表明通过提高蕉园土壤pH值防控枯萎病危害的思路是可行的[11-13]。本研究将在前人基础上，将蕉园酸性土壤改良作为防控香蕉枯萎病的措施之一，通过施用本研究室研制的酸性土壤改良剂改善土壤pH值，研究枯萎病防控效果。

综上所述，为有效防控香蕉枯萎病发生，需从降低土壤酸化和抑制病原菌入侵两方面着手，但已有的报道大多仅关注其中一个方面，有关两者结合协同防控香蕉枯萎病的研究鲜有报道。因此，本研究选用生物有机肥和放线菌菌剂作为生防材料分别与酸性土壤改良剂结合，研究两者协同防控香蕉枯萎病的效果，以期为蕉园土壤改良和病害防控提供新的综合措施和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试生防材料包括：生物有机肥为“馕播王”复合微生物肥料（BIO）（总养分6%，有效活菌数≥0.2×108 CFU/g）（江苏省江阴市联业生物科技有限公司）和放线菌菌剂（Act）（粉剂，活菌数为2.0×1010 CFU/g）。酸性土壤改良剂（ASA）由本研究室研制，颗粒状。供试香蕉苗品种为巴西蕉，无毒苗；枯萎病病原菌菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense为4号生理小种，两者均由广东省农业科学院果树研究所提供。供试土壤为发病蕉园病原土，采自广东省广州市南沙区某蕉园，尖孢镰刀菌数量经Komada H选择性培养基[14]检测，数量为107 CFU/g干土。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 盆栽试验于2015年7月至9月在广东省农业科学院农业资源与环境研究所温室进行。试验用病原土经充分混匀后，与适量健康土混合，用病原菌孢子液调节土壤尖孢镰刀菌初始含量至105 CFU/g干土，每盆装15 kg土。试验共设7个处理：（1）CK：病原土，不施用生防制剂和酸性土壤改良剂，即化肥处理（尿素，磷酸二铵和硫酸钾，各处理氮磷钾肥按尿素4.26 g/15 kg土，磷酸二铵1.30 g/15 kg土，硫酸钾2.62 g/15 kg土；（2）ASA：病原土，添加酸性土壤改良剂（0.5%土重）；（3）Act：病原土，添加放线菌菌剂（0.5%土重）；（4）BIO：病原土，添加生物有机肥（0.5%土重）；（5）ActA：病原土，添加酸性土壤改良剂（0.5%土重）和放线菌菌剂（0.5%土重）；（6）BIOA：病原土，添加酸性土壤改良剂（0.5%土重）和生物有机肥（0.5%土重）；（7）CK0：以从未种植过香蕉的健康土作为种植土壤，作为阴性对照。每处理10盆，每盆种植1株苗，所用蕉苗已长至6片叶，共70盆。移苗之前，将酸性土壤改良剂、生防制剂及两者的混合物与土壤充分混匀。各处理养分用化肥补齐以保持一致，常规水分管理。

1.2.2 测定指标及方法 移苗完成后，每天记录香蕉发病情况，待对照处理发病率达80%以上时结束试验。香蕉发病指数分级为：0级为健康，1级为1%～25%叶片出现萎蔫，2级為26%～50%叶片萎蔫，3级为51%～75%叶片萎蔫，4级为75%以上叶片萎蔫或全株死亡。发病率的计算公式为：发病率（DI）=[∑（发病指数×该级别指数的植株数量）/（总植株数×最高级别发病指数）]×100%。生防率计算公式为：生防率=[（对照发病率-处理发病率）/对照发病率]×100%。

至试验结束时，测定香蕉植株生长情况：用皮尺测量植株茎粗和株高后将整株香蕉苗取出，将根系上黏附的土壤用自来水洗净，吸水纸吸干表面水分后称量植株鲜重，之后装入袋中放入烘箱于105 ℃下杀青15 min后70 ℃烘至恒重，称重，每个处理3个重复。

微生物计数：取整株香蕉苗时，抖落根系上黏附的土壤，取1～2 g根系装入自封袋中，并放入冰盒保存，每个处理取3个重复。样品带回实验室后，称取1 g根系至9 mL无菌水中，用斡旋仪充分震荡混匀样品，采用连续稀释涂布法对根际土中的细菌、真菌、放线菌和病原菌数量进行计数，所用培养基分别为牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏1号和Komada H选择性培养基。

土壤样品理化性质测定：测定指标包括有机质、有机碳、全氮、有效磷、速效钾和电导率，测定方法参照《土壤农化分析》进行。

1.3 数据分析

数据统计和分析软件为Excel 2007和SigmaPlot 12.5。

2 结果与分析

2.1 不同处理对香蕉枯萎病的防控效果

添加生防制剂及与ASA配施均显著降低了香蕉植株的发病率（图1）。试验持续56 d，至试验结束时，CK0处理未出现发病症状；对照发病率高达90%，放线菌与ASA协同防控处理的发病率最低，为35.0%，经统计生防率达61.1%；其次为生物有机肥与ASA协同防控处理，生防率达58.3%；单施酸性土壤改良剂、放线菌菌剂和生物有机肥处理的发病率均高于与ASA协同处理，分别为45.1%、39.6%和42.4%。试验表明，添加ASA能促进生防制剂更好的发挥生防效果，可能因为ASA可调节提高土壤pH值，使其往不利于病原菌生长而利于生防制剂生长的方向发展。

2.2 不同处理对根际土壤pH值的影响

各处理香蕉根际土壤pH值均显著高于对照（p<0.05）（图2）。处理土壤初始pH值为5.47，试验结束时，对照pH值下降至5.13，而其余处理均有所上升，上升幅度最小的为Act处理，pH值为5.57，与ASA协同处理后，ActA处理的pH值为最高值5.99。处理BIOA的土壤pH值亦高于BIO处理，前者为5.78，后者为5.66。表明，生防制剂能改善土壤pH值，使其有所提高，不利于病原菌的生长，进而影响发挥生防效果。添加ASA协同防控处理能更好更显著的提高土壤pH值，为提高生防率奠定基础。

2.3 不同处理对根际病原菌数量的影响

添加生防制剂及与ASA协同防控均显著降低根际土壤中病原菌的数量（图3），试验结束时，对照根际病原菌数量达7.46 lg CFU/g干土。协同防控处理ActA和BIOA的根际病原菌数量低于单施处理Act和BIO以及ASA处理，5个处理中数量最高的是BIO处理，为4.79 lg CFU/g干土，最低数量为ActA处理的4.06 lg CFU/g干土。表明，生物有机肥和放线菌菌剂中富含的具有抑菌作用的功能菌株能有效抑制香蕉根际病原菌的生长，添加ASA后效果增强，表明通过调节改善土壤酸性条件，可促进生防制剂更好的发挥防控效果。

2.4 不同处理对根际微生物数量的影响

与对照相比，各处理均能显著提高根际细菌和放线菌数量，而降低真菌数量（图4）。至试验结束时，对照根际细菌数量为6.51 lg CFU/g干土，显著低于CK0（7.49 lg CFU/g干土）（p<0.05），其余处理中最低值为处理Act的7.85 lg CFU/g干土，最高值为处理BIOA的8.04 lg CFU/g干土，協同处理BIOA和ActA的根际细菌数量均高于单施处理BIO和Act，但差异不显著（图4-A）。细菌是土壤微生物中数量最多的类群，其数量变化可在一定程度上反映出土壤微生物多样性的变化。各处理能显著提高根际细菌数量，表明土壤微生物多样性提高，使土壤微生物群落往“健康”方向发展。添加ASA协同作用效果更佳，表明通过调节提高土壤pH值，可使其有利于细菌生长，从而在一定程度上不仅促进功能菌的定殖，也有利于细菌的繁殖。

处理中真菌数量最高的为BIO处理，值为4.00 lg CFU/g干土，但仍显著低于对照5.07 lg CFU/g干土（p<0.05）（图4-B）。除CK0外，5个处理中作用最显著的为ActA处理，该处理真菌数量低至3.55 lg CFU/g干土，与对照相比降低了30.0%；其次为BIOA处理，该处理数量高于ActA，但两者不存在显著差异。土传病害病原菌多为真菌，根际真菌数量减少表明各处理功能菌能显著抑制病原真菌生长，从而降低真菌数量。添加ASA后，土壤酸性条件得到改善，pH值上升，有利于土壤中细菌和放线菌的生长繁殖而不利于喜酸真菌的生长，使其繁殖受限，进而数量下降。

各处理显著提高了香蕉根际放线菌的数量（p<0.05）（图4-C），其中作用效果较强的为Act和ActA处理，两者处理根际放线菌数量分别为5.91 lg CFU/g干土和6.02 lg CFU/g干土，与对照相比分别增加了21.6%和23.9%。BIO和BIOA处理效果稍弱，根际放线菌数量分别为5.32 lg CFU/g干土和5.65 lg CFU/g干土，分别较对照增加了9.4%和16.3%。与上述4个处理相比，单施ASA处理根际放线菌数量最低，为5.65 lg CFU/g干土。Act和ActA处理富含放线菌，有利于增加土壤放线菌数量，这些菌株可代谢产生多种抑菌抗生素，菌株数量的增加表明抗生素产量的增加，有利于抑制病原菌的繁殖，使土壤根际微生物群落向健康方向发展。

2.5 不同处理对香蕉生长的影响

与对照相比，各处理显著提高了香蕉植株的株高和茎粗（p<0.05），植株鲜重和干重均有所增加（表1）。除CK0外，处理BIOA的株高和茎粗增加幅度最大，分别比对照增加了46.8%和13.4%；株高增幅最小的处理为Act，增长了32.9%，而茎粗增幅最小的处理为BIO，增长9.7%。在生物量方面，BIOA处理增加效果最显著，鲜重和干重增幅分别为33.3%和42.9%；BIOA和ActA对植株干重的影响显著高于相应的ASA、BIO和Act处理（p<0.05）。表明，生防制剂的添加可能抑制了病菌的生长，减少其入侵植株根系，从而保障植株正常生长。添加生物有机肥比放线菌菌剂更好的提高植株生物量，可能由于生物有机肥中含有有机载体，可为香蕉生长提供养分，而放线菌菌剂养分含量则较少，因此促生效果较弱。

2.6 不同处理对土壤理化性质的影响

CK0对照土壤各项理化性质均低于其他处理（表2），且除有效磷之外，其余各项指标差异均达显著水平（p<0.05）。处理ASA、BIO、Act、ActA和BIOA土壤的有机质、有机碳、速效钾和电导率均高于对照CK，表明生防制剂可有效调节提高土壤养分；但全氮含量与CK差异较小，仅BIOA与CK存在显著差异；而土壤有效磷含量方面，BIOA处理显著低于CK。虽然CK0处理土壤养分含量较低，但由表1可知，CK0处理植株生物量高于其他处理，可能由于CK0为化肥处理，养分较易被植株吸收，有利于植株生长，在整个试验过程中没有追肥措施，至试验结束时，土壤中的养分可能已被植株大量利用，使得残留养分较少；而处理BIO、Act、ActA和BIOA中含有有机载体，其中含有的养分释放较慢，可持续供给植株，但这些处理的植株由于受病原菌威胁，可能影响了植株生长。

3 讨论

生防制剂与酸性土壤改良剂能协同防控香蕉枯萎病，这一综合防控措施的生防效率高于单独施用生防制剂的效果，且有利于改善香蕉根际微生物多样性。与酸性土壤改良剂协同应用的生防制剂中即分别含有生防细菌和放线菌，酸性土壤的改良不仅有利于提高土著细菌和放线菌的数量，更为两种功能微生物提供了有利的活动场所，使其更有效的发挥生防作用。酸性土壤改良剂的应用可有效提高土壤pH值，使其显著高于对照，土壤酸性有中和趋势。本研究应用的酸性土壤改良剂偏碱性且富含有效钙和磷的无机矿物质，能有效提高土壤pH值，降低土壤中交换性H+和交换性Al3+的含量，是农业生产中改良反酸田的适宜改良剂[15]。有研究表明，土壤pH值的升高与病害发生呈显著的负相关关系；而在香蕉移栽前添加石灰等改良剂中和土壤酸性有利于破坏香蕉枯萎病发病条件而防控病害发生[13，16]。有关香蕉根际酸性土壤改良能防控枯萎病发生的机理已有报道，香蕉枯萎病病原菌是喜酸真菌，酸性土壤改良剂的改良效果使得香蕉枯萎病菌逐渐失去最适土壤环境，而偏中性的土壤环境有利于细菌或放线菌等有益微生物的活动和繁殖，从而改善土壤微生物的多样性，进而对香蕉枯萎病产生一定的防控作用[10，17-18]。此外，本研究应用的微生物有机肥包含有效的有机载体，总养分含量为6%，有利于其中含有的功能细菌在土壤中存活，拮抗菌在有机肥协助下形成“基质-菌群”生态系统，可改变香蕉根际土壤微生物生态特征和物理化学特性，有利于调节土壤微生态环境，降低病原菌数量，从而起到防病作用[19-21]。有田间试验表明，连续施用生物有机肥能优化连作蕉园土壤微生物群落多样性，防控香蕉枯萎病的发生，提高香蕉产量并改善果实品质[22-24]。本研究应用的另一种生防制剂为放线菌菌剂，该产品由放线菌和发酵载体组成。放线菌作为生防菌株应用于土传病害防控已有很多报道，在黄瓜和香蕉枯萎病防控上均有研究[1，25-26]，表明放线菌用于生物防控具有极大潜力。

综上所述，酸性土壤改良剂与生防制剂协同应用的综合措施有利于提高防效。初步研究表明该作用的机理在于：酸性土壤改良剂可提高香蕉根际土壤pH值，使其不利于病原真菌生长，从而降低根际土壤病原菌数量，而偏中性环境有利于细菌和放线菌生长，可保障生防制剂中的拮抗细菌和放线菌的生存和繁殖，从而提高两者在土壤中的数量，进而促进生防制剂更有效的发挥防控效果。有关这两者在田间对香蕉枯萎病的协同防控效果还有待进一步验证。

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