大根唇柱苣苔的组培快繁技术

林茂 李进华 唐庆 王华新 廖美兰 龙定建

摘 要 以大根唇柱苣苔叶片为外植体，以 MS为基本培养基，附加不同种类和浓度的激素进行组培快繁技术研究。结果表明：适宜叶片不定芽诱导的培养基是MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L，继代增殖培养的适宜培养基为MS+6-BA 1.50～3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L，适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.20～0.30 mg/L，适宜的基质是泥炭 ∶ 珍珠岩=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 细河沙=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 园土=2 ∶ 1。

关键词 大根唇柱苣苔；组培；快繁；不定芽

中图分类号 Q949.778 文献标识码 A

Abstract The leaf of Chirita macrorhiza was used as the explants and cultured on MS medium supplemented with different concentrations of plant hormones. The results showed that： the adventitious bud induction culture medium was MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L. The shoots proliferation medium was MS+6-BA 1.50-3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L. The root induction medium was 1/2MS+IBA 0.20-0.30 mg/L. The suitable ratio of transplanting medium for peat ∶ perlite was 2 ∶ 1，peat ∶ fine sand is 2 ∶ 1，and peat ∶ soil was 2 ∶ 1.

Key words Chirita macrorhiza； tissue culture； rapid regeneration； adventitious bud

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.020

大根唇柱苣苔（Chirita macrorhiza D. Fang & D. H. Qin）为苦苣苔科唇柱苣苔属的多年生草本植物。唇柱苣苔属植物是苦苣苔科的一个比较突出的种群，全世界约140种或更多，中国已知的约99种，是唇柱苣苔属植物的分布中心，集中在华南和西南岩溶山地丘陵地带，种类分布区域十分狭窄[1]。中国拥有丰富的苦苣苔科植物资源，但被利用的种类很少。大根唇柱苣苔叶片形态多样、花色丰富艳丽、株型紧凑美观，符合人们对花卉追求的“新”、“奇”、“珍”、“稀”等的审美需求，具有极大的市场前景。大根唇柱苣苔长期处理野生状态，虽然近年受到苦苣苔科植物爱好者的广泛关注，但多数民众对其缺乏认识，致使一直未能得到商品开发，观赏价值也未得到充分利用。至今，有关大根唇柱苣苔的研究极少，仅在引种[2]及生理指标测定[3]上有少量涉及。为更好地推广利用大根唇柱苣苔，充分发挥其观赏特性，增加花卉市场的品种种类，加大其相关繁育技术研究是当前亟待解决的问题。而组培快繁技术是推进商品化进程的有效途径之一。本试验以大根唇柱苣苔的叶片为外植体，通過不定芽诱导途径建立组培快繁技术体系，为大根唇柱苣苔商品化、规模化的种苗繁育提供技术指导，也为今后的品种选育、遗传转化研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用植株是由广西壮族自治区林业科学研究院提供的野生大根唇柱苣苔。

1.2 方法

1.2.1 不定芽诱导 春季（3～5月份）取大根唇柱苣苔的幼嫩叶片，用洗衣粉浸泡5 min后，在流水下冲洗干净。随后在超净工作台上操作。先将叶片用75%酒精浸泡20 s后，用无菌水冲洗3遍，再用0.1%升汞浸泡叶片12 min，用无菌水冲洗3遍。最后将叶片切成1 mm×1 mm的大小，接种到添加了不同激素种类和浓度的MS培养基上进行不定芽诱导。每种培养基接种100片，重复3次。30 d后统计叶片的诱导情况，并筛选出不定芽的最适诱导培养基。

培养基：基本培养基是MS、1/2MS，均加4 g/L的琼脂固化，pH5.8～6.0。其中1/2MS培养基中的大量元素以及白砂糖含量均为MS培养基的一半，其余成分及含量相同。下同。

培养条件：培养温度为（25±1）℃，光照时间12～14 h/d，光照强度为1 500～2 000 lx。下同。

1.2.2 不定芽增殖 选取长势、高度相对一致的不定芽，接种在添加了不同激素种类和浓度的MS培养基上进行不定芽的继代增殖培养，每种培养基的接种量为100株，重复3次。观察不定芽的继代增殖和生长情况，30 d后，统计新芽数，计算增殖系数，并筛选出最适宜的继代增殖培养基。

1.2.3 不定根诱导 当组培芽高约2～3 cm时，将其接种在添加了不同激素种类和浓度的MS、1/2MS培养基上进行不定根的诱导，每种培养基的接种量为100株，重复3次。观察小苗的生根及生长情况，20 d后，统计生根数并计算生根率，筛选出最适宜的生根培养基。

1.2.4 炼苗移栽 将已生根的组培苗放在自然条件下炼苗3 d，揭盖后用少量水软化培养基，再炼苗2 d。将小苗根部培养基冼净后用0.5% KMnO4溶液消毒10～15 min，再移栽在不同的基质上，浇透定根水，每种基质移栽100株，重复3次。20 d后统计成活率。筛选出最适宜的移栽基质。

1.3 统计分析

利用SPSS软件进行试验数据的统计检验、方差分析、多重比较和统计计算工作。

2 结果与分析

2.1 不同激素组合对不定芽诱导的影响

不同激素组合对大根唇柱苣苔不定芽诱导的影响见表1。从表1可看出，A7处理的诱导率、不定芽数显著高于其他处理，分别为87.33%、334.00个。A1、A2、A3处理的诱导率无显著差异，并显著低于其余处理的诱导率，均为0，无愈伤和不定芽组织的产生。A4、A5、A8、A9处理的诱导率无显著差异，A6、A10、A11处理的诱导率无显著差异，但这些处理在切口处有新芽产生，数量及大小各不相同，其中A6、A10、A11这3种处理的不定芽数显著高于A4、A5、A8、A9的不定芽数，后4种处理的不定芽数显著高于A1、A2、A3处理的不定芽数。由此表明，仅添加细胞分裂素的培养基对不定芽的诱导无显著影响，将细胞分裂素与生长素配合使用，才能诱导不定芽的发生。随着6-BA和NAA浓度的增加，诱导率呈上升趋势，当6-BA为1.00 mg/L、NAA为0.05 mg/L，诱导率达最大，为87.33%，且产生的不定芽数量很多。IAA的变化趋势和NAA相同，但其诱导率均较低。说明，培养基上添加不同种类和浓度的激素，对大根唇柱苣苔的不定芽诱导的影响不同，当6-BA为1.00 mg/L、NAA为0.05 mg/L，诱导率达最大，即培养基MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L是最适宜的不定芽诱导培养基（图1）。

2.2 激素组合对继代增殖培养的影响

不同激素组合对大根唇柱苣苔不定芽继代增殖的影响见表2。从表2可看出，S5、S6、S7、S8处理的增殖系数无显著差异，但显著高于其余处理的增殖系数；在NAA浓度相同的条件下，随着6-BA浓度的增加，增殖系数先增加后降低，但差异不显著，这表明6-BA对继代增殖的影响不显著。在6-BA浓度相同的条件下，随着NAA浓度的增加，植株的生长情况差异较大，低浓度的NAA植株长势差，不定芽细弱，且伴随玻璃化现象，随着浓度的增加，长势好转，并且玻璃化减少，但是浓度过大长势仍会变差。说明，适宜大根唇柱苣苔继代增殖培养的培养基为MS+6-BA 1.50～3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L，增殖系数较高，植株长势好，芽健壮，玻璃化极少（图2）。

2.3 不同培养基及激素配比对不定根诱导的影响

不同IBA浓度对大根唇柱苣苔的生根影响见表3。由表3可看出，G1和G7处理的生根率无显著差异，且显著低于除G2以外的其他处理的生根率；G8、G9、G10、G11、G12处理的生根率无显著差异，其中G9、G10的生根率较高，分别为90.67%、90.33%；G3、G4、G5处理的生根率无显著差异。由此可知，在相同的基本培养基上，不同IBA浓度对大根唇柱苣苔的生根影响不同。在不添加IBA的培养基上，生根率显著偏低；在添加了IBA的培养基上，生根率显著偏高，随着浓度的增加，生根率的增加并不显著，但植株的生长情况有所好转，其中，当IBA浓度为0.2 mg/L或者0.3 mg/L时，生根率较高，植株健壮，根系较多，有利于后期的移栽。说明，大根唇柱苣苔的适宜生根培养基为1/2MS+IBA 0.20～0.30 mg/L，植株健壮，根系多（图3、4）。

2.4 炼苗与移栽

不同移栽基质对大根唇柱苣苔移栽的影响见表4。由表4可看出，M1、M2、M3、M4处理的成活率相互之间存在显著差异；M5、M6、M7处理的成活率无显著差异，成活率分别为99.00%、97.67%和95.33%，显著高于M1、M2、M3、M4处理的成活率。由此可知，不同移栽基质对移栽成活率的影响不同。在以单一成分的介质为移栽基质时，成活率较低，植株恢复慢，长勢差；当以泥炭和其他介质混合为基质时，成活率显著增加，但相互之间的成活率差异不大，在这些基质上的植株恢复快，长势好。说明，适宜大根唇柱苣苔移栽的基质是泥炭 ∶ 珍珠岩=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 细河沙=2 ∶ 1或者泥炭 ∶ 园土=2 ∶ 1，植株恢复快，长势好。

3 讨论

植物通过外植体诱导并获得完整组培苗植株的发生途径有不定芽、愈伤组织、器官发生、原球茎等。外植体先脱分化为愈伤组织，再由愈伤组织分化形成丛生芽，然后生根形成完整植株，这种途径称为愈伤组织途径。外植体不经过愈伤组织阶段而直接脱分化产生器官的途径为不定芽途径。在现有的唇柱苣苔植物的组织培养研究中，多数都是通过不定芽途径来获得完整植株的[4-6]，其中有以叶片[7-10]为外植体，有以花梗、花蕾[11]为外植体，而通过种子、茎段为外植体的未获得其完整植株[12]。以愈伤组织途径进行相关研究不多，余海霞等[13]是以叶片通过愈伤组织途径建立三苞唇柱苣苔的组培快繁技术，冼康华等[14]以肉质叶为外植体建立了文采唇柱苣苔的组织培养和快速繁殖。本试验以大根唇柱苣苔幼嫩叶片为外植体，通过直接诱导不定芽，建立了组培快繁体系，这种通过不定芽途径获得的植株发生变异少，能够保持母本的优良特性，同时还可缩短繁育进程，是优良种苗商品化繁育的极佳途径。

组培苗的移栽成活以及移栽后的生长状况受基质影响。基质物理性质及化学成分不同，成活率有所差异，主要原因在于这些基质的保水性、保肥能力以及透气性不同。本试验发现，在大根唇柱苣苔的移栽过程中，基质对移栽成活率的影响极大。单一使用某种成分的介质作为栽培基质时，移栽成活率显著低于两种成分的介质混合成的基质。单独使用泥炭、珍珠岩、细河沙或者园土时的移栽成活率低，原因可能是：珍珠岩和细河沙的保水能力都较差，园土的透气性差，而泥炭的保水性和透气性都很好。泥炭是目前国内外种苗生产中应用最广泛的栽培基质之一，疏松且富含腐殖质。将泥炭混合其他介质，使移栽基质同时具有良好透气性、保水性和一定肥力，一方面有利于通气条件的改善，促进根系的生长，另一方面可降低生产成本，是大根唇柱苣苔的极佳种植基质。

4 结论

本试验以大根唇柱苣苔叶片为外植体，通过不定芽途径成功建立了其组培快繁技术，其中，适宜叶片不定芽诱导的培养基是MS+6-BA 1.00 mg/L+NAA 0.05 mg/L，继代增殖培养的适宜培养基为MS+6-BA 1.50～3.00 mg/L+NAA 0.10 mg/L，适宜的生根培养基为1/2MS+IBA 0.20～0.30 mg/L，移栽基质是泥炭 ∶ 珍珠岩=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 细河沙=2 ∶ 1、泥炭 ∶ 园土=2 ∶ 1。

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