肠道菌群与草鱼个体大小相关性研究

王微微　高丽丽　王小敏　徐运娥　周安

摘要[目的] 探讨草鱼肠道菌群与草鱼个体大小之间的相关性。[方法] 采用DGGE方法对同一批孵化并在同一池塘中养殖的个体大小显著差异的草鱼肠道样品进行分析。[结果] 无论大个体草鱼还是小个体草鱼，其肠道优势菌群均为厚壁菌门和变形菌门，但2组草鱼在其肠道菌群的结构和多样性等方面存在差异。大个体草鱼肠道中存在着更多比例的厚壁菌门以及具有纤维素降解能力的细菌，而小个体草鱼肠道中存在较多的潜在致病菌。[结论] 草鱼肠道微生物可以作为内在因素影响草鱼的生长性能，这一结果也为进一步开发可促进草鱼生长性能的益生菌奠定了研究基础。

关键词草鱼；肠道微生物；个体大小；变性梯度凝胶电泳

中图分类号S917文献标识码A文章编号0517-6611（2017）33-0153-05

Study on the Correlation in Grass Carp （Ctenopharyngodon idella） between Intestinal Microbiota and Body Size

WANG Weiwei，GAO Lili，WANG Xiaomin et al

（Teching and Research Office of Microbiology， Zunyi Medical University， Zunyi， Guizhou 563000）

Abstract[Objective] This study assessed the correlation in grass carp （Ctenopharyngodon idella） between intestinal microbiota and body size. [Method] The bacterial community structures in the intestinal content and mucosa of the two groups of grass carp with the different body size were revealed by PCRDGGE fingerprinting. [Result] The phyla Firmicutes and Proteobacteria were dominant in grass carp intestine independent of the body size. However， the DGGE profiles and sequence analysis of grass carp in fast growing group and slow growing group showed the differences in structure and diversity of intestinal bacterial communities between the two groups. The fast growing grass carp was associated with phylumlevel changes in the bacterial community. The relative proportion of Firmicutes was higher in fast growing ones， and more bacteria previously reported to degrade cellulose were only present in this group. Conversely， slow growing grass carp may have more population of potentially pathogenic bacteria， which might affect the growth performance of host. [Conclusion] These findings preliminarily demonstrated the intestinal microbiota could be an important internal factor affecting body size of grass carp. This research will facilitate the next step in investigating the beneficial bacteria which could improve the growth performance of grass carp.

Key wordsGrass carp （Ctenopharyngodon idella）；Intestinal microbiota；Body size；Denatured gradient gel electrophoresis （DGGE）

魚类的体表和体内均有微生物的存在，消化道作为营养物质消化吸收的场所，其中定殖了数量巨大、种类繁多的微生物。在长期的进化过程中，微生物、肠道与宿主三者之间建立了共生的关系，并且研究认为肠道微生物是宿主机体重要的“微生物器官”[1]。微生物在鱼类肠道中从无到有的定殖是一个复杂的过程，其群落组成受到很多因素的影响，比如宿主种类、发育过程、饵料类型、环境因素等[2-5]，这些在鱼类肠道中定殖的微生物能够在宿主的生长发育、营养代谢、病原防御和免疫调节等方面发挥重要作用。在促进宿主的营养代谢方面，肠道微生物既可以作为营养来源供宿主利用，也可以产生一些酶促进宿主对食物的消化，从而使宿主获得有利于自身生长发育和维持健康所需的能量。由此可见，肠道微生物已成为影响宿主代谢、能量获得以及生长性能等的一个重要因素[6]，可以通过分析具有生长性能差异的宿主肠道微生物组成特点，获得更有益于宿主生长健康的微生物种类。

早期对小鼠和人的研究便已证实肠道微生物与肥胖的发生密切相关，研究发现肥胖小鼠的肠道中拥有数量较多的厚壁菌门（Firmicutes）和较少的拟杆菌门（Bacteroidetes），并且肥胖个体的肠道菌群获取能量的能力更强，从而有利于单糖的吸收和甘油三酯在脂肪细胞中储存[7-8]。有关鱼类的研究，早在20世纪90年代Ring等[9]就发现生长速度不一样的北极红点鲑肠道微生物组成具有差异性。Sun等[10]仅在生长快的斜带石斑鱼肠道中发现了对弧菌具有拮抗作用的几种细菌，说明生长快的个体肠道中拥有更有益的微生物群。随后的研究发现鱼类肠道优势菌群拟杆菌门和厚壁菌门的丰度以及两者组成比例也同样会影响鱼类生长速度和个体大小[11-13]。这些研究对于水产养殖特别是经济鱼类的养殖十分重要，因为养殖过程中鱼类出现较大的个体生长差异将会显著地降低养殖产量，使鱼类养殖业承受很大的负面影响[9]。

草鱼（Ctenopharyngodon idella）是典型的草食性鱼类，广泛地分布于全国各地，因其易饲养、生长快、群体产量高，已成为淡水养殖的当家品种之一。草鱼相关生物学参数的研究结果显示，草鱼肠道全长与体长的比值（比肠长）不高（仅为2.13），食物在草鱼肠道内停留时间为4～18 h[14-16]，表现出鱼类自身消化道短且食物在其中停留时间短的特点，将会导致食物消化不完全，从而影响草鱼对营养成分的充分吸收[17]。草鱼肠道中微生物会促进宿主对营养物质的代谢，因而充分了解其肠道微生物群落组成显得十分重要。已有研究发现草鱼肠道优势菌群为变形杆菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门和拟杆菌门[18-19]。这些肠道微生物在草鱼营养代谢方面发挥了重要的作用，如具有降解纤维素能力的弧菌属（Vibrio）、芽胞杆菌属（Bacillus）和肠杆菌属（Enterobacter）等细菌[20-23]；此外，Wu等[18]发现草鱼肠道中具有潜在多糖分解能力的厌氧芽胞杆菌（Anoxybacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、梭状芽胞杆菌属（Clostridium）等细菌。尽管有较多关于草鱼肠道微生物群落结构的研究，但是，草鱼个体大小差异是否与肠道微生物组成有关的研究依然欠缺，而分析这些草鱼个体的肠道微生物组成将为深入揭示肠道益生菌的作用机理、肠道微生物群落与草鱼生长性能的关系等提供更为丰富的资料。

在草鱼养殖过程中发现，同一养殖池塘中同批次的二龄草鱼出现了大小分化的社会等级现象，同一池塘中既有个体大的草鱼，也有个体小的草鱼，且个体大小差异显著。笔者拟采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）的方法研究同一养殖池塘中个体大小差异显著的草鱼肠道微生物，建立其肠道微生物的DGGE指纹图谱，分析草鱼肠道菌群的群落结构和多样性，以期从肠道微生物的角度探讨引起草鱼生长差异的原因，旨在为开发促进草鱼消化吸收的饲用微生物添加剂以及健康生态养殖等提供理论基础。

1材料与方法

1.1样品采集

该试验所用草鱼均来自湖北省石首市老河长江“四大家鱼”国家级原种场。在同一养殖池塘中，对二龄草鱼进行采样，分别采集大个体草鱼和小个体草鱼各5尾。同时，采集草鱼养殖池塘中水体的底泥样品。

1.2试验方法

按照无菌操作对草鱼进行处理，使用75%乙醇对鱼体表面消毒，并按无菌操作取每组5尾草鱼的肠道，参照Ring等[24]的方法取草鱼肠道的内容物和肠道黏膜样品，分别混合均匀。

1.2.1基因组DNA提取。

草鱼肠道内容物和肠道黏膜细菌总DNA的提取，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）（百泰克，北京），具体步骤完全参照试剂盒说明书。将提取后的总DNA用1%琼脂糖检测，并于-20 ℃保存备用。

水体微生物总DNA的提取，利用高速离心的方法富集样品中细菌后，采用改良的CTAB法提取细菌基因组；底泥微生物总DNA的提取，主要参照Zhou等[25]基于SDS的土壤微生物总DNA提取的方法。水体和底泥样品中微生物总DNA提取后，均放于-20 ℃保存备用。

1.2.216S rDNA PCR扩增。

将草鱼、水体和底泥各样品的菌群基因组DNA进行巢式PCR[26]，即進行2轮PCR。第一轮PCR采用细菌16S rDNA的通用引物27F和1492R进行扩增，扩增产物稀释100倍作为第二轮PCR的模板，第二轮PCR使用引物U968-GC和L1401扩增细菌16SrDNA的V6～V8可变区。该试验所使用的引物序列见表1。

第二轮PCR反应体系（终体积25 μL）：1 μL模板、0.2 μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTP、1×Ex Taq缓冲液、1.25 U Ex Taq DNA聚合酶，灭菌超纯水补足到25 μL。PCR扩增在TC-512梯度PCR仪中进行，每个样品做3个平行对照。PCR反应条件：94 ℃变性4 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检验，将每个样品的3个平行PCR产物充分混合用于DGGE分析。

1.2.3变性梯度凝胶电泳（DGGE）及指纹图谱分析。

DGGE图谱构建使用Bio-Rad Dcode突变检测系统（Bio-Rad，US）完成。具体方法：聚丙烯酰胺凝胶的浓度为8%，变性梯度范围为40%～60%，电泳缓冲液为1×TAE。电泳条件：电泳温度为60 ℃，130 V电压预电泳10 min，80 V电压电泳16 h。电泳结束后，银染并使用白光投射仪对凝胶成像。DGGE凝胶图谱使用Quantity One分析软件（Quantity One 46.2，Bio-Rad）进行标化处理，并进行相似性分析。聚类分析使用XLSTAT 7.5.2软件，并应用UPGMA算法进行。此外，使用软件Canoco for windows 4.5对各样品进行PCA主成分分析。

45卷33期王微微等肠道菌群与草鱼个体大小相关性研究

1.2.4DGGE凝胶条带切胶回收和克隆测序。

将DGGE凝胶图谱上的共性条带和特异性条带用灭菌的手术刀切割下来，条带回收参照Brunvold等[27]的方法并略有修改，即将切下的条带浸泡于100 μL的灭菌超纯水，于30 ℃放置数小时后，4 ℃过夜。参考Sekiguchi等[28]的方法構建DGGE凝胶回收条带的随机克隆文库，取1 μL为模板，使用引物U968/L1401，按照“1.2.2”的PCR反应体系和条件再次扩增16S rDNA的V6～V8可变区。每个条带样品做3个平行，并将其PCR产物混合和纯化。PCR纯化产物与pMD-18T载体连接，并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，用氨苄青霉素抗性平板随机挑选阳性克隆并测序，测序结果在GenBank数据库中对比分析。最后，在MEGA4.0软件中，根据Kimura-two-parameter model遗传距离模型[29]，使用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。

2结果与分析

2.12组草鱼体长、体质量基本信息

该试验采集的2组草鱼，大个体的5尾草鱼体长平均为（31.7±1.1）cm，体质量平均为（403.2±48.8）g；小个体的5尾草鱼体长平均为（17.8±0.7）cm，体质量平均为（62.2±18.6）g。T检验结果显示，2组草鱼样本的体长和体质量在统计学上均存在显著性差异（P<0.001）。

2.2草鱼肠道以及水体和底泥菌群的DGGE指纹图谱

对大个体草鱼和小个体草鱼肠道的内容物和黏膜微生物以及水体和底泥微生物的16S rDNA V6～V8可变区片段进行PCR扩增，构建了菌群多样性DGGE指纹图谱，结果如图1所示。指纹图谱不同泳道的条带数目和强度以及条带的迁移率都表现出一定的差异性，说明各样品中细菌群落结构存在差异。条带的位置不同代表不同的细菌；条带的亮度反映了细菌相对生物量的多少；条带的多少直观地说明了样品中细菌群落的多样性。由DGGE指纹图谱可以看出，除了在每个泳道中均存在的1个条带之外，各样品泳道呈现不同条带，表现出菌群组成的差异（图1A）。

2.3各样品菌群的多样性分析和聚类分析

草鱼、水体和底泥各样品DGGE条带分析显示，2组草鱼肠道样品的物种丰富度均不低于10，水体样品的物种丰富度较高（21），而底泥样品丰富度最低。Shannon指数H显示，最高值为水体样品，而2组草鱼的肠道样品高于2.28（表2）。

基于各样品的DGGE指纹图谱，根据各泳道条带丰富度计算Dice相似性系数，对草鱼肠道、水体和底泥样品进行UPGMA分析后，结果显示草鱼的肠道内容物样品聚为一支，而草鱼肠道黏膜样品聚为一支（图1B）。PCA主成分分析结果也显示了大个体草鱼和小个体草鱼的肠道内容物样品聚在一起，2组草鱼的肠道黏膜样品聚在一起，说明草鱼肠道黏膜和内容物菌群组成有一定的差异性。此外，PCA主成分分析结果又显示草鱼肠道样品各聚在一起，且都与环境样品（底泥和水体）区分开，表明2组草鱼的肠道微生物组成差异性可能是由底泥和水体环境之外的因素造成的（图1C）。

2.4草鱼肠道微生物的群落结构

使用RDP的Classifier工具对DGGE指纹图谱中各样品泳道割胶的25条条带（图1A）构建的克隆文库测序结果进行分析，并对草鱼肠道样品的DGGE条带的序列构建系统发育树（图2）。大个体和小个体草鱼的肠道菌群主要组成为变形杆菌门和厚壁菌门。同样地，养殖环境水体（W）和底泥（S）的菌群也主要由这两大类的细菌组成。其中，大个体草鱼的肠道黏膜（BM）菌群包括变形菌门中的α-变形杆菌（5.26%）、β-变形杆菌（10.53%）、γ-变形杆菌（26.32%）和δ-变形杆菌（526%），以及厚壁菌门（36.84%）和疣微菌门（Verrucomicrobia）（15.79%）；大个体草鱼的肠道内容物（BC）菌群由变形菌门中α-变形杆菌（20%）和γ-变形杆菌（20%），以及放线菌门（Actinobacteria）（20%）和厚壁菌门（40%）组成；小个体草鱼的肠道黏膜（SM）的细菌群落组成由γ-变形杆菌（60%）和厚壁菌门（30%），以及一类分类尚不明确的细菌（10%）构成；小个体草鱼的肠道内容物（SC）菌群包括厚壁菌门（50%），梭杆菌门（Fusobacteria）（12.5%），疣微菌门（12.5%）和变形菌门（12.5%）和一类无法分类的细菌（125%）。进一步通过NCBI数据库的BLAST工具对各样品的DGGE切胶条带的序列信息分析，结果显示其中多数条带的序列信息与已有数据库中未经分离纯培养的细菌（uncultured bacterium）相似。

3讨论

草鱼是我国重要的淡水养殖鱼类，草鱼肠道微生物的研究较多且主要集中在草鱼肠道微生物群落结构以及纤维素水解相关微生物分类培养、不同环境因素对草鱼肠道微生物群落的影响等，但是缺少关于草鱼个体大小与草鱼肠道微生物群落结构之间关系的研究[4，18，22，23，30]。在草鱼池塘养殖过程中，发现同一池塘中草鱼出现了大小个体分化的社会等级现象。通过DGGE方法对大个体和小个体2组草鱼的肠道微生物分析后，发现2组草鱼的肠道微生物组成存在一定的差异，且差异的产生与环境（水体和底泥）因素无关。

以往研究发现在投喂不同饵料、不同养殖环境和模式下的草鱼肠道优势菌群都是变形菌门和厚壁菌门[18-19，31-32]，而且这2个细菌类群与宿主代谢因素有着重要的关系[11]。与这些研究相同的是，该研究的2组草鱼肠道微生物群落由变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门、放线杆菌门和疣微菌门组成，并且变形菌门和厚壁菌门也为2组草鱼肠道的优势菌群，这一结果说明宿主遗传结构是肠道微生物形成和群落结构组成的一个重要影响因素[3]。然而，基于DGGE指纹图谱的UPGMA聚类分析结果显示，草鱼肠道黏膜菌群和内容物菌群在其结构上表现出一定的差异性，其中草鱼肠道黏膜菌群中超过80%的细菌属于厚壁菌门和变形菌门，然而2门类的细菌在草鱼肠道内容物菌群中所占比例下降，这种差异性可能与肠道不同部位菌群发挥作用的差异性有关，如黏膜菌群更贴近于肠道上皮细胞，有利于营养物质的交换[33]。

該研究DGGE指纹图谱的多样性分析显示，2组草鱼肠道黏膜菌群的物种丰度和多样性均存在差异，这种差异的产生可能与小个体草鱼长期处于不同的社会等级以及受到环境胁迫和摄食压力有关，因为规格较大的鱼类个体往往会优先抢占食物资源和更好的生活空间[34]。DGGE条带测序结果显示，大个体草鱼的肠道黏膜菌群拥有更高比例的厚壁菌门，这可能与厚壁菌门的细菌能够促进肠上皮细胞的吸收且涉及到宿主能量平衡有关[35]，同时该类细菌也具有高效的多糖发酵能力[11]。此外，在同一养殖池塘中，大个体草鱼作为等级地位较高的优势者，可能会抢占食物资源并抑制小个体草鱼摄食行为，这就可能造成小个体草鱼营养摄入不足，从而导致小个体草鱼肠道黏膜菌群中厚壁菌门比例减少[36]。

从2组草鱼肠道黏膜和内容物菌群的具体组成情况来看，放线菌仅存在于大个体草鱼肠道中，由于放线菌是一类能够在草鱼肠道中起到分解纤维素作用的细菌[18]，因而大个体草鱼会具有较强的纤维素消化降解能力，从而获取更多的能量。相对于大个体草鱼而言，小个体草鱼肠道中存在着较多比例的气单胞菌（Aeromonadaceae）和假单胞菌（Pseudomonadaceae）种类。气单胞菌是一类常见的鱼类潜在致病菌，可以引起鱼类多种疾病的发生，影响鱼类个体的生长发育[37]；而假单胞菌中的一些种类也可以引起鱼类疾病，如草鱼的赤皮病[38]。由此可见，小个体草鱼的肠道中存在较多比例的潜在病原菌可能是造成其生长速率低的一个因素。

4结论

草鱼肠道微生物群落结构会因草鱼个体大小差异而有所不同，说明在相同的养殖环境下肠道微生物作为内在因素影响草鱼的生长性能。该研究结果也从肠道微生物的角度说明草鱼分级养殖和轮捕轮放模式既可以防止不同规格草鱼抢食能力不同而导致生长速度的不同，又可以避免因长期处于饥饿胁迫引起鱼类消化酶的降低[39-40]。此外，该研究结果显示大个体草鱼肠道中可能存在更多有助于其营养代谢的微生物，如果能够从中分离到相关微生物并探讨其在草鱼肠道中发挥的功能，将有助于开发促进草鱼消化吸收以及提高其生长性能的益生菌。

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