广西部分地区常见猪群疫病感染情况检测

韦显凯 闭璟珊 蒋晓霞

摘要[目的]检测广西猪群主要疫病的感染状况。[方法]2015年，从发病猪场和屠宰场采集猪组织样品276份，应用RT-PCR方法检测猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV），并应用PCR方法检测猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病病毒（PRV）。[结果]发病猪场中，CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒感染率分别为3.98%、11.36%、0、28.98%和4.55%，而屠宰场猪CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒的感染率分别为1.00%、2.00%、0、29.00%和3.00%。对猪群混合感染情况分析发现，PCV2和其他病原的混合感染率最高。其中，发病场二重感染率最高的为PRRSV+PCV2，达到5.11%，其次为PCV2+PRV和PRV+PRRS， 阳性率均为0.57%。屠宰场二重感染率最高的是PCV2+PRV，阳性率为1.00%。[结论]在发病猪场和屠宰场中，猪圆环病毒2型的感染率最高，且常与其他病原发生混合感染，伪狂犬病毒感染率较2014年有所下降。

关键词猪群； 流行病学调查；多重感染；广西

中图分类号S858.28文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）36-0085-03

Abstract[Objective]To detect the infection situations of normal swine diseases in Guangxi.[Method] 276 swine tissue samples were collected from diseased pig farms and slaughter houses，classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） and porcine epidemic diarrhea virus（PEDV） were detected by RTPCR， porcine circovirus 2（PCV2） and porcine pseudorabies virus（PRV） were detected by PCR.[Result] The infection rates of CFSV，PRRSV，PEDV，PCV2，PRV in diseased pig farms were 3.98%，11.36%，0，28.98% and 4.55%， respectively， and those in the slaughter houses were 1.00%，2.00%，0，29.00% and 3.00%， respectively.The analysis of the mixed infection in pig herd showed that the coinfection rate of PCV2 with other viruses was the highest.In the diseased pig farms， PCV2+PRRSV was the most universal double infection， the positive rate was 5.11%， posteriorly was PCV2+PRV and PRV+PRRS， the positive rates of the both were 0.57%.In the slaughter houses， PCV2+PRV was the most universal double infection， the positive rate was 1.00%.[Conclusion]PCV2 had the highest infection rate not only in morbidity farms， but also in slaughter houses.And PCV2 coinfection with other virus was universal.The infection rate of PRV was descend compared with that in 2014.

Key wordsPig herd；Epidemiological investigation；Multiple infection； Guangxi

豬瘟（Classical swine fever，CSF）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）、猪流行性腹泻病（Porcine epidemic diarrhea，PED）、猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus associated disease，PCVAD）和猪伪狂犬病（Porcine pseudorabies，PR）是近年来流行和危害较为严重的猪群疫病，这 5种传染病中的任何一种一旦发生，都会给猪场造成巨大的经济损失。因此，在养猪生产中必须做好 CSF、PRRS、PED、PCV2 和PR这5种传染病的防疫工作 [1-3]。

目前，我国对猪瘟的防控以疫苗免疫为主，取得了一定的效果，但猪瘟在我国仍时有发生[4]。猪瘟一直困扰着养猪业的健康发展，主要以急性发病、高稽留热、小血管壁变性、全身性小点状出血及脾脏边缘梗死为主要病理变化。目前猪场现状是猪瘟频发，以非典型猪瘟为主，有的地方还可以看见非常明显的猪瘟，其主要原因有疫苗质量不合格、疫苗运输冷链管理不规范、疫苗免疫操作不当、猪群免疫抑制疾病干扰等[5]。高致病性猪蓝耳病自2006年至2010年在我国多个省（市）引发了多起 、多轮疫情。自2011年以来，病毒变异度逐年下降、趋于稳定，疫情强度随之明显下降。 目前的主要问题是高蓝变异株与经典株并存、欧洲株与美洲株并存。猪繁殖与呼吸综合征以引起猪群免疫力严重降低，易继发感染等为主要特征，是目前影响猪场健康的重要动物疫病之一[6]。自2010年以来，随着猪流行性腹泻病毒新毒株的出现，该病在我国的流行情况更为严重。由于疫苗毒株与流行毒株不匹配、免疫途径不能产生满意的黏膜免疫，商品灭活疫苗的免疫预防效果不佳[7-8]。猪圆环病毒相关疾病 （PCVAD）是由PCV2感染引起的，对猪的感染率较高，在世界范围内广泛发生，严重影响养猪业的发展，近年来已成为危害我国养猪业的主要疾病之一[9]。猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒引起的多种家畜和野生动物的一种高度接触性传染病，可导致怀孕母猪发生流产、死胎、木乃伊胎，哺乳仔猪出现神经系统症状，死亡率在90%以上，并表现出从单一感染向混合感染扩大的趋势，给全球养猪业造成了巨大的经济损失。自2011 年以来，伪狂犬病在我国部分猪场中出现大面积感染现象，包括已接种基因缺失苗的规模化猪场，阳性率普遍升高，疫情日趋严重[10]。

尽管养殖户对上述疫病的防控都十分重视，很多猪场也采取了严格的疫苗免疫措施，但仍不能有效控制上述疫病的发生和流行。为了解广西猪群主要疫病的流行情况，笔者于2015年从广西不同地区发病猪场和屠宰场采集猪组织样品，并应用RT-PCR和PCR方法对5种病原进行检测，分析其单一感染和多重感染情况，旨在为广西猪群主要疫病的预防和控制提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品采集。按照动物疫病实验室病料样品采集方法，2015年从广西壮族自治区南宁市、柳州市、玉林市、博白县、灵山县等地的发病猪场采集不同日龄病死猪的肺脏、脾脏和淋巴结组织样品 176份；从南宁市、柳州市、玉林市、博白县、灵山县等地的屠宰场采集肺脏、脾脏和淋巴结组织样品100份。将采集的样品送至广西动物疫病预防控制中心，经处理后取上清组织液，置于-70 ℃低温冰箱中冷冻保存备用。

1.1.2试剂。RNA 和DNA提取试剂盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0）、一步法RT-PCR试剂（PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2）、PCR试剂Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye），均购自TaKaRa 公司。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成。参照我国农业标准合成特异性引物，采用RT-PCR方法进行猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪流行性腹泻的病原学检测，采用PCR方法进行猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病的病原学检测，RT-PCR和PCR引物序列见表1。

1.2.2病毒核酸的提取。每份采集病料取2 g左右，按1∶5的比例加入生理盐水进行研磨，冻融2次后，10 000 r/min离心3 min，取200 μL上清液，用 RNA/DNA提取试剂盒提取病毒核酸，操作方法按照说明书进行。

1.2.3RT-PCR和PCR。①RT-PCR反应体系（25 μL）：2×One Step Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，RNA 3 μL，PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 1 μL，用无菌水补足25 μL。RT-PCR反应程序：50 ℃ 30 min；95 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min。②PCR反应体系：2×Premix PCR Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，DNA 3 μL，用无菌水补足25 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃预变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃再延伸10 min。

1.2.4PCR产物的鉴定。取RT-PCR或PCR产物6 μL在1.0%琼脂凝胶上进行电泳。如果检测样品出现预期阳性对照大小的条带，则判定为阳性，否则判定为阴性。

1.2.5感染情况的鉴定。对采集病样分别进行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PEDV的病原学检测，同一份样品只能检测到1种病原呈阳性的为单一感染，同时检测到2种病原呈阳性的为二重感染，同时检测到3种及以上病原呈阳性的为三重以上感染。

2结果与分析

从广西5个地区共采集发病猪以及屠宰场猪组织样品325份，所有的样品均进行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PEDV病原学检测，阳性样品RT-PCR/PCR预期扩增产物大小分别为508、433、1 154、217和663 bp，5种病毒的电泳图谱如图1所示。对检测结果进行感染率、单一感染、二重感染及多重感染的分析结果见表2～5。

2.15种病原检測结果

由表2可知，在5种病原中，检出率最高的是PCV2，阳性率高达28.99%，其次为PRRSV（阳性率达7.97%），PRV和CSFV阳性率分别为3.99%和2.90%，最低的为PEDV（阳性率为0）。其中，PCV2在发病场和屠宰场的检出率分别为28.98%和29.00%。CSFV、PRRSV和PRV在发病猪场的检出率均高于屠宰场。这表明PCV2是感染猪群的主要疫病，健康猪和发病猪均有较高的感染率，而PRRSV、PRV和CSFV主要在发病猪中检出。

2.2单一感染情况

由表3可知，PCV2的单一感染率最高，在发病场和屠宰场中分别为23.30%和28.00%；PEDV的单一病原感染率最低，在发病场和屠宰场中均为0。这表明PCV2无论发病猪还是健康猪都有很高的单一感染率。

2.3二重感染情况由表4可知，在发病场中，PCV2和其他病原的混合感染最为多见。其中，感染率最高的是PRRSV+PCV2，达到5.11%；其次为PRRSV+PRV和PCV2+PRV，阳性率均为0.57%。屠宰场二重感染较多的是PCV2+PRV，阳性率为1.00%。这表明在发病猪场中PRRSV+PCV2是最为普遍的混合感染情况。

2.4三重以上感染情况

此次检测三重感染的在发病猪场和屠宰场均未检测到。2014年发病猪场PRRSV+PEDV+PCV2和PRRSV+PCV2+PRV的三重感染率均为2.29%，屠宰场CSFV+PCV2+PRV三重感染率为0.67%。与2014年相比，2015年多重感染情况减轻。

3讨论与结论

猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型是引起母猪繁殖障碍以及造成猪场损失较大的猪群疫病，猪流行性腹泻使初生仔猪腹泻死亡，给猪场带来巨大的经济损失。检测发病猪场以及屠宰场中这些动物疫病对于预防和控制猪群疫情具有重要意义。

在所有样品中，PCV2的检出率最高，说明PCV2不仅在发病猪场中有较高的感染率，而且在无发病症状的猪群中也同样存在。該病毒能引起免疫抑制，造成其他疫病的疫苗免疫后抗体产生不良反应。近年来，随着 PCV2灭活疫苗的使用，其流行情况得到了一定程度控制，但在临床检测诊断中仍有 PCV2感染病例不断出现，加之与其他疾病的混合感染，PCV2感染控制的形势仍然十分严峻[11]。当前猪病的一大特征就是混合感染病例增多，使得诊断和治疗难度加大、治疗成本上升、治愈率下降，且这种混合感染呈逐渐增长趋势。PCV2和其他疫病病原的混合感染最为严重，具有免疫抑制作用，在感染后机体免疫力受到抑制，容易继发感染其他动物疫病[12]。猪繁殖与呼吸综合征病毒的一个显著特征就是对巨噬细胞的嗜性，在巨噬细胞内进行杀伤性复制，造成机体内各种组织器官的巨噬细胞被大量破坏[13]，PRRSV和PCV2的混合感染最为常见。

该研究中PRV的检出率比2014年要低，说明伪狂犬病在采样地区的感染率有所下降。猪伪狂犬病发病率自2011年冬季以来，不同规模猪场发病病例明显增多，波及仔猪、保育猪、育肥猪甚至种猪等不同阶段猪群，导致母猪流产，哺乳仔猪脑炎、死淘率高，保育猪与育肥猪呼吸道问题等。董和平等[14]认为，这与猪伪狂犬病病毒毒力和免疫原性基因发生改变有关。迄今为止，免疫接种仍然是预防和控制该病的有效办法。通过对猪场分离的伪狂犬病野毒来测定疫苗免疫后血清的中和抗体水平是选择疫苗毒株的科学方法。

猪流行性腹泻在近几年的流行情况比较严重，给养殖户造成了极大的经济损失。尽管许多养殖场已执行猪流行性腹泻的免疫程序，但腹泻情况仍时有发生。由于猪流行性腹泻病毒发生变异，商品灭活疫苗由于疫苗毒株与流行毒株不匹配，肌肉注射免疫途径不能产生有效的黏膜免疫，免疫预防效果不佳[7-8]。部分猪场常常使用腹泻仔猪小肠返饲母猪，由于腹泻也是伪狂犬病的症状之一，因此当猪场使用返饲技术紧急预防仔猪流行性腹泻时，如果仔猪小肠中含有伪狂犬病毒，则不可避免地传播扩散伪狂犬病毒[10]。

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