流动注射化学发光测定头孢类药物研究

王伟　赵凯

摘要：分子发光光谱分析法中的化学发光分析法作为一种有效的分析方法，主要依据是检测体系的化学发光强度与体系中待测物浓度在一定条件下将会呈现出线性定量关系的原理，并通过仪器对体系化学发光强度进行检测，因此可确定待测物含量的一种分析方法。此分析方法具备设备简单，线形范围宽，灵敏度高等优点，与流动注射相结合将表现出精密程度高，容易实现自动化并且具有分析速度快等特点。文章对近些年头孢类药物的流动注射化学发光检测进行了总结。

关键词：化学发光法；流动注射；头孢类药物

化学发光分析法（ChemiLuminescence，CL）是根据化学反应过程当中产生的辐射光的强度来确定各种物质含量的分析方法，指的是某些化学反应过程中发出可见光的现象。其发光的反应机理是反应体系中的某些物质的分子吸收了反应所释放出的能量而由基态跃迁到激发态，然后再由从激发态返回到基态，同时将能量以光辐射的形式释放产生化学发光其过程可表示为A+B→C*+D，C*→C+hv或A+B→C*+D，C*+F→F*+c，F*→F+hv。将化学发光反应应用于分析化学当中，据某一时刻的发光强度或者反应的总发光量来确定整个体系当中的相对应组分含量的分析方法叫作化学发光分析法。该种方法虽然具有仪器简单、线性范围宽、灵敏度高并且不存在空白的优点，但化学发光现象出现时间短并且随时间变化发光强度会有较大变化，而且受到环境因素的影响较大，导致反应进程很难控制，选择性和重现性都较差，很难实现自动化等。流动注射技术却可以弥补此法的不足之处，所以将流动注射技术与化学发光法有机地结合起来，集二者之优点，最终就可实现自动化，而且还能将化学发光信号的重现性显著提高，因而，化学发光分析法成了一种灵敏、高效的痕量和超痕量分析技术。

目前，主要使用的化学发光反应体系有：（1）Ce（Ⅳ）—Rh6G：（2）高锰酸钾；（3）磷钼钒杂多酸—鲁米诺；（4）Luminol—H₂O₂；（5）鲁米诺—高锰酸钾；（6）NBS—荧光素等。作为高效的痕量和微量分析方法，化学发光分析法有其独特的优势，在生命科学、医学等领域中的应用前景都较为广泛。本研究从对与生命相關物质以及目前各种药物和药物在人体中代谢产物的化学发光分析进行了简要综述。

1头孢类药物

头孢类药物属于头孢菌素类抗生素，微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物即为抗生素。将微生物生物合成的抗生素为基础，并对其结构进行改造，得到的具有新的抗菌活性的化合物即为半合成抗生素。头孢类抗生素的共同结构如图1所示。

头孢菌素类抗生素有两个不同的侧链集团R₁与R₂，并且可以在这两处引入不同的功能基团，因此可以合成一系列头孢菌素；其中抗菌活性决定基团为R₁影响抗菌效率以及药代动力学的性质的为R₂。近年来一直占抗生素类药物首位的为头孢菌素类抗生素。因此测定分析该种类药物都有着极其重要的意义。在这些检测方法中有高效液相色谱法、荧光法、吸附极谱法、化学发光法等。现对化学发光法进行综述。

2测定头孢类药物常用的化学发光体系

2.1 Ce（IV）—Rh6G化学发光体系

试验研究表明，Ce（Ⅳ）氧化含巯基（—SH）的化合物会产生弱发光，Rh6G也能够大大增强此弱发光，据此建立了测定头孢类—内酰胺类抗生素的FIA—CL分析方法。杨季冬等在选定的最佳条件下，经测试对头孢拉定，硫酸铈浓度为0.010 mol/L时化学发光强度为最大；而对头孢哌酮，硫酸铈浓度为0.005 mol/L时化学发光强度为最大，几个典型的头孢类抗生素化学发光强度均在1.0×10^-8～1.5×10^-5g/mL范围内且与其发光强度呈良好的线性关系。

范顺利等研究发现，在Na₅P₃O₁₀的增敏下，Ce（Ⅳ）与β—内酰胺菌素作用可产生较强的荧光性，而与某些含巯基的化合物作用则产生化学发光。Ce（Ⅳ）与头孢氨苄直接作用没有化学发光产生；但将头孢氨苄预先水解再与Ce（Ⅳ）作用，因其水解产物1含有巯基，则可产生化学发光。经实验证实了这一推测，并且发现罗丹明6G对该发光体系具有很强的增敏作用。研究还得到当罗丹明6G的浓度为1.0×10^-4mol/L，H₂SO₄浓度和加热时间分别为1.6 mol/L，15 min，Ce（Ⅳ）与H₂O₄混合载液的流速为10 mL/min，载液HSO₄的浓度为0.3 mol/L，Ce（Ⅳ）的浓度为0.02 mol/L时为最佳试验条件，在选定的最佳试验条件下，测定发光强度k（相对发光强度单位）与头孢氨苄质量浓度c（mg/L）在0.10～10.0 mg/L范围内呈线性关系，其回归方程Ia=0.33+1.59c（n=11，r=0.999 4）。对1.00 mg/L头孢氨苄标准溶液进行了11次平行测定，相对标准偏差为0.8%，根据IUPAC的规定计算出该方法的检出限为0.06 mg/L。

周杰等研究发现有一定的巯基存在头孢他啶的降解产物当中，运用流动注射化学发光法考察了Ce（Ⅳ）与此降解产物作用而产生化学发光的条件，研究表明罗丹明6G对该体系有着较强的增敏作用，据此建立了测定头孢他啶的新方法。研究发现当罗丹明6G浓度为5×10^-5，H₂SO₄浓度为1.6 mol/L、时间为10 min、硫酸铈溶液浓度为0.02 mol/L、主泵速为30 r/min（硫酸铈溶液）、副泵速为20 r/min（H2S04溶液）时为最佳试验条件。对6.0mg/L头孢他啶标准溶液进行10次平行测定，相对标准偏差为1.1%。根据3S/K，计算出该方法的检出限为0.070 mg/L，试验结果较满意。

2.2 Mn（Ⅲ）化学发光反应体系

在强酸性介质中，基于初生态Mn（Ⅲ）直接氧化头孢拉定产生强化学发光，将在线恒电流电解产生Mn（Ⅲ）与流动注射技术相结合，创建了流动注射电化学发光法测定头孢拉定的新方法。陈小利等在优化的试验条件下，发现MnSO₄浓度为0.2 mol/L，H₂SO₄的浓度约等于3.0 mol/L、电解电流为12.0 mA、流速为2.0 mL/min时电化学发光强度最大，在上述最佳的选定实验条件下，头孢拉定的电化学发光强度与其质量浓度在1 0×10^-7～5.0×10^-5g/mL范围内有良好的线性关系。

2.3高锰酸钾化学发光体系

在强酸性介质中，基于KMnO₄氧化头孢类药物能产生化学发光，采用流动注射技术，建立了头孢类抗生素药物的测定新方法。实验表明在有甲醛存在的情况下，头孢菌素类抗生素可直接被酸性KMnO₄氧化并产生强烈的化学发光，头孢类抗生素的浓度与其发光强度呈良好的线性关系。并在HCl浓度为1.5 mol/L，HCHO体积分数6%，KMnO₄浓度为3.2×10^-4mol/L，进样泵的泵速为20 r/min，载流泵的泵速为22 r/min，进样体积为100 pL，光电倍增管—800V的试验条件下，最终试验表明，其发光强度与头孢氨苄的质量浓度在0.8～25 g/mL范围内呈良好的线性关系，头孢拉定的线性范围为0.8～2 g/mL。

2.4磷钼钒杂多酸—鲁米诺化学发光体系

瞿鹏等基于鲁米诺在NaOH介质中，磷钼钒杂多酸可将其氧化产生较强的化学发光，头孢曲松钠能够强烈抑制其化学发光，据此建立了磷钼钒杂多酸一鲁米诺一头孢曲松钠化学发光抑制法测定头孢曲松钠的新体系，并结合流动注射分析技术测定药品中的头孢曲松钠.在磷酸二氢钠质量浓度为8.0×10^-6g/mL、钒酸钠质量浓度为2.0×10^-6g/mL，H₂SO₄的浓度为0.01 mol/L，NaOH的浓度为0.1 mol/L，3.0 mL/min作为载流的流速时，相对化学发光强度与头孢曲松钠的质量浓度在4.0×10^-7～4.0×10^-5g/mL范围内呈线性关系；此方法的检出限为8×10^-8g/mL对8.0×10^-6g/mL的头孢曲松钠连续进行11次测定，相对标准偏差为2.8%。此方法已被成功地应用于头孢曲松钠药品的测定。

2.5 Luminol—H₂O₂化学发光体系

武现丽等利用在碱性介质中，头孢哌酮钠对Luminol—H₂O₂化学发光体系有着较大的增强作用，建立了头孢哌酮钠流动注射化学发光测定法。武现丽等选择0.01 mol/LNaOH溶液为反应介质、Luminol的浓度为2×10^-4～mol/L，H₂O₂的浓度为0.8mol/L为最佳试验条件。在选定的最佳试验条件下，头孢哌酮钠质量浓度在5.0×10^-7×4.0×10^-5g×mL范围内，与发光强度增强值成良好的线性关系。

2.6鲁米诺—高锰酸钾发光体系

陈麒等研究表明孢氨苄抗生素在对鲁米诺一高碘酸钾化学发光反应中有很强的增敏作用，因此通过优化试验条件，并构建了头孢氨苄的流动注射化学发光分析法。他们在多次试验中得到当氢氧化钠的浓度为0.1 mol/L、鲁米诺浓度为1.0×10^-4mol/L，KIO₄浓度为1.0×10^-5mol/L为最佳试验条件，在此条件下得到检出限为9×10^-10g/mL，线性范围为1×10^-9g/mL～2×10^-7g/mL，相对标准偏差小于2%。此法用于头孢氨苄胶囊中药物含量的测定，结果较满意。

王珏等研究发现，头孢他啶对鲁米诺一高锰酸钾的体系有着明显增敏作用，将纳米金加入体系后，其增敏作用会显著增强。通过运用流动注射化学发光法，在鲁米诺一高锰酸钾的发光体系中加入纳米金，其体系的发光强度显著增强，因此构建了测定头孢他啶的新方法。研究表明当纳米金粒径为16 nm，NaOH的浓度为0.18 mol/L、纳米金浓度为3.5×10^-5mol/L、高锰酸钾浓度为6.0×10^-4mol/L、鲁米诺的浓度为8.0×10^-4mol/L为试验最佳条件。在最佳的试验选定条件下，将同一个系列的不同浓度的头孢他啶溶液进行分析测定。最终得出在加入纳米金后，测得的头孢他啶灵敏度更高、检出限更低、线性范围变宽。

2.7鲁米诺—铁氰化钾发光体系

当前，临床上医学应用最广泛的长效、第三代广谱头孢菌素类抗生素

是头孢曲松钠，所以测定对其药物制剂的测定分析对于临床用药安全合理性都有着重要的意义。试验发现，基于在碱性介质中头孢曲松钠对鲁米诺—铁氰化钾化学发光体系都有着较强的增强作用，据此建立了流动注射化学发光測定头孢曲松钠的新方法。经过试验研究得知，当鲁米诺浓度为8×10^-4mol/L，K₃Fe（CN）₆溶液浓度为4.0×10^-4mol/L，NaOH浓度为0.20 mol/L时为最佳试验条件，在选定的最佳条件下，得到该方法的测定范围为0.1～400 mg/L，检出限为0.06 mg/L.对0.2 mg/LCRO溶液进行10次平行测定，相对标准偏差为1.6%。

2.8 NBS—荧光素化学发光体系

张淑琼研究在氢表明在氧化钠介质中，盐酸头孢吡肟可以被N一溴代琥珀酰亚胺（NBS）氧化并产生微弱的化学发光，在与荧光素共存的状态下可产生较强的化学发光，因此结合流动注射技术，可建立测定盐酸头孢吡肟的流动注射化学发光方法。研究发现，当熒光素浓度为3 mmol/L、氢氧化钠浓度为0.05 mol/L、NBS浓度为0.025 mol/L时为最佳试验条件，在最佳的试验选定条件下，发光强度与盐酸头孢吡肟质量浓度在0.05 mg/L～10 mg/L范围内呈良好的线性关系。其线性方程ΔI=147.34 c+5.741 3（c：mg/L，R₂=0.999 9）。对5.000 mg/L盐酸头孢吡肟连续平行测定11次，相对准标准偏差（Relative Quasi Standard Deviation，RSD）为43%。

何树华等研究表明头孢吡肟和头孢克肟在碱性的介质中被NBS（N一溴代琥珀酰亚胺）氧化后，其产生的能量可激发共存的荧光素，从而产生化学发光，据此建立了一种直接测定头孢吡肟与头孢克肟的化学发光方法。研究表明，当荧光素浓度超过4.0 mmol/L，NaOH浓度为0.05 mol/L，NBS的最佳浓度均为0.03 mol/L为最佳试验条件，在最佳试验条件下，对盐酸头孢吡肟和头孢克肟进行测定，对5 mg/L的头孢吡肟平行测定11次，其RSD为2.5%。根据IUPAC建议，计算得检出限为5.7 g/L；对0.5 mg/L的头孢克肟平行测定11次，其RSD为2.9%，计算得检出限为0.048 mg/L。

3展望

化学发光分析法因为其仪器设备简单、灵敏度高，并且可以与其他技术的联合使用，所以应用范围会不断扩大，特别是在环境监测分析与免疫分析上会有更加广泛的应用。当前开发简便经济且具有高发光率的新发光试剂仍是重点研究方向。这种分析方法因其具有灵敏度高、线性范围宽、仪器设备简单等独特的优势而普遍被人们所接受并重视。伴随着各种新的化学发光体系的不断涌现，一定会完善和丰富原有的化学发光体系，使得化学发光分析法的应用更加广泛，尤其是与CE，HPLC等方法联用对各种药物进行检测分析，更凸显其潜在的优势，作为分析化学较为活跃的新发展领域。

4结语

作为一种有效的分析测试手段，化学发光分析法具有广泛的应用前景，从药物的测试分析来看，伴随着人们健康水平不断地提高，人们对于用药的安全合理性、有效性提出了更高的要求，特别是药物在人体内不断地变化，从而直接影响）2t门对这种药物的评价，所以化学发光分析将会在药物测试分析中有着更广阔的应用，然而还可以作如下改进：（1）若使化学发光分析法能更广泛地应用于药物的测试分析，则需要通过大量的实验和反复考查论证才能够被广泛地接受，而且通过大量的普及与推广，才能不断地完善和发展化学发光分析法。（2）化学发光分析方法仪器设备简单，易于操作和推广，凭借它独特的优势，在未来的几年间在基层药事业单位普及化学发光分析方法，对合理安全用药会起到很大帮助，也会产生不同的经济和社会效益。