吡喹酮及其主要代谢产物在草鱼体内代谢动力学研究

朱凤娇 张洪玉 谢欣燕 胡鲲

摘要 [目的]研究吡喹酮及其主要代謝产物在草鱼体内的代谢动力学规律。[方法]运用高效液相色谱法（HPLC），研究淡水草鱼在单次口灌给药10 mg/kg剂量条件下，鱼体各组织中吡喹酮（PZQ）及吡喹酮一羟基代谢物（M1）的药动学差异。[结果]草鱼血浆、肠道、肝脏和肾脏内PZQ在各个时间点的药物浓度存在极显著差异（P<0.01）；PZQ在血浆、肠道、肝脏和肾脏的达峰时间分别为1.0、0.5、1.0和1.0 h，而药物峰浓度为0.41、0.45、0.72和0.44 mg/L，M1在血浆、肠道、肝脏和肾脏的达峰时间分别为48.0、0.5、6.0和48.0 h，而药物峰浓度为0.72、0.45、0.42和0.42 mg/g。这表明PZQ在草鱼体内吸收分布快，M1的达峰时间滞后于PZQ。二者达峰浓度相似表明M1是PZQ在草鱼体内主要代谢物。PZQ在血浆、肠道、肝脏和肾脏的消除半衰期（t1/2）分别为16.41、4.77、37.16和8.74 h，M1在血浆、肠道、肝脏和肾脏的消除半衰期（t1/2）分别为124、71、246和162 h，其消除半衰期明显比PZQ长，说明在鱼体中M1的残留时间比PZQ更长。[结论]在实际生产中，应注意对M1的检测。

关键词 吡喹酮及其代谢产物；草鱼；吸收；残留；消除

中图分类号 S941 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0088-04

Pharmacokinetics Study on Praziquantel and Its Major Metabolites in Grass Crap

ZHU Feng-jiao，ZHANG Hong-yu，XIE Xin-yan，HU Kun* （National Pathogen Collection Centre for Aquatic Animals，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306）

Abstract [Objective] To study the pharmacokinetics laws of parziguantel （PZQ） and its major metabolites in grass crap.[Method] Using high performance liquid chromatography （HPLC），the pharmacokinetics differences of PZQ and its major metabolite（M1）in each tissue of freshwater grass crap after oral administration with the dosage of 10 mg/kg were studied.[Result] There were significant differences of PZQ concentration in the plasma，intestinal tracts，liver and kidney of grass crap at different time points （P<0.01）.The peak concentration of PZQ in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 0.41、0.45、0.72 and 0.44 mg/L respectively and it reached peak concentrations at 1.0、0.5、1.0 and 1.0 h respectively.The peak concentration of M1 in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 0.72、0.45、0.42 and 0.42 mg/L respectively and it reached peak concentrations at 48.0、0.5、6.0 and 48.0 h respectively.These results showed that the absorption and distribution of PZQ was faster in grass carp and its peak time was earlier than M1.The peak concentration of PZQ and M1 were similar，which showed that M1 was major metabolite of PZQ in grass carp.The elimination half-life （t1/2） of PZQ in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 16.41、4.77、37.16 and 8.74 h respectively.And the elimination half-life of M1 in the plasma，intestinal tracts，liver，kidney of grass crap were 124、71、246 and 162 h respectively，which was significant longer than that of PZQ.These results indicated that the residual time of M1 in grass carp was longer than that of PZQ.[Conclusion] The residues of M1 should be detected in the actual production.

Key words Praziquantel and its metabolites； Grass crap； Absorption； Residue； Elimination

吡喹酮（Praziquantel，PZQ）是我国20世纪80年代初人工合成的吡嗪并异喹啉化合物，为无色或白色结晶性粉末，微溶于水，可溶于氯仿、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂[1]。目前，吡喹酮主要作为人和动物日本血吸虫、曼氏血吸虫、埃及血吸虫、东毕血吸虫病的首选药物[1-3]，同时吡喹酮作为一种新型广谱抗寄生虫病药物，对三代虫、指环虫、拟指环虫都有很强的杀灭作用，且能有效治疗由单殖吸虫感染引起的鱼体皮肤和鳃疾病[4-7]。由于其杀虫效果显著，吡喹酮已被广泛应用于国内外水产养殖寄生虫疾病的治疗。目前，国内外关于吡喹酮的药物代谢动力学研究主要集中于其在大鼠[8]、家兔[9]、绒山羊[10]、人体内的药代动力学研究等[11]。在水产动物上的药物代谢动力学研究并不多，集中于吡喹酮原型药在虹鳟[12-13]、石斑鱼[14]、草鱼[15]中的药物代谢动力学研究，而关于吡喹酮在水产动物体内的代谢产物的药物代谢动力学研究较少。Diekmann等[16]对吡喹酮在小鼠肝脏代谢后的代谢产物进行了研究，发现吡喹酮代谢后被氧化成几种不同的羟化产物。其中，一羟基代谢物（1个羟基环己基甲酰基取代吡喹酮胺）（简称M1）的含量最高。

草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是我国重要的淡水经济鱼，其养殖分布范围极广。笔者以草鱼为研究对象，以单次口灌10 mg/kg给药的方式，研究给药后不同时间草鱼各组织中吡喹酮及其代谢产物的药动学变化，旨在为指导其临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

Aglient-1100型高效液相色谱仪配自动进样器和荧光检测器，为美国Aglient公司产品；漩涡混合器，为美国Thermo fisher公司产品；旋转蒸发仪，为德国Eppendorf公司产品；精密电子天平（METTLER AB104-N）；高速冷冻离心机，为德国Eppendorf公司產品。

1.2 药品与试剂

吡喹酮一羟基代谢物（M1）标准品（纯度96.5%），由里海生物技术公司合成；吡喹酮标准品（纯度为99.9%），购自Sigma-aldrich 公司；吡喹酮原料药（纯度为98%），购自河北峰华制药有限公司；色谱纯乙腈，购自德国默克公司；乙酸乙酯、乙醇、异丙醇和正己烷均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司。

1.3 试验动物

试验所用草鱼购自江苏省南通国营农场，平均体重（80.0±6.8）g，对鱼体表进行观察，并进行解剖观察。60条草鱼暂养在水族箱（100 cm× 80 cm× 80 cm），试验用水为充分曝气的自来水，水温控制在（15±1）℃，并使用增氧泵24 h充氧，暂养7 d。暂养期间每2 d换水1次，每次换水量1/3，早晚饲喂全价饲料，灌药前1 d停止饲喂。

1.4 试验方法

1.4.1 给药和取样。

试验用鲫鱼共50尾，每个时间点取5尾。用少量乙醇预溶吡喹酮原料药，再用超纯水定容配制成2 g/L口灌溶液，并加入少量食用色素使溶液呈红色，以便观察回吐情况。将试验鱼用套有塑料软管的注射器以10 mg/kg的给药剂量单次口灌吡喹酮溶液，无回吐者保留试验。给药前禁食24 h，给药后6 h投饵，并在给药后15和30 min以及1、3、6、12、24、48、96 h分别取血浆、肝脏、肠道、肾脏样品，将取得样品置于-80 ℃下保存。

1.4.2 样品前处理方法。

将样品从低温冰箱取出，室温解冻。取1 mL血浆或1 g组织匀浆置于15 mL离心管中，加入3 mL乙酸乙酯，漩涡振荡3 min后4 500 r/min 离心10 min，取上清液置于另一干净10 mL离心管；用3 mL乙酸乙酯重复提取1次后，合并上清液；45 ℃恒温条件下旋转蒸干，加1 mL流动相振荡溶解3 min；再用1 mL正己烷去脂2次，取下清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后置于进样瓶中，用高效液相色谱进行检测。

1.4.3 色谱条件。

色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18 分析柱（4.6 mm×150 mm×5 μm）。流动相为乙腈∶水（V/V=50∶50） ；激发波长为265 nm，发射波长为280 nm；流速1 mL/min；柱温25 ℃；进样量为20 μL。

1.4.4 吡喹酮及其代谢物标准溶液的配制和标准曲线的制备。

准确称取吡喹酮标准品和吡喹酮一羟基代谢物（M1）标准品各0.01 g，分别用少量乙腈溶解后，用超纯水定容至100 mL，配制成100 μg/mL标准储备液，然后再用流动相分别稀释成质量浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL共9个质量浓度梯度的标准溶液，使用HPLC仪分别测定其峰面积，然后分别绘制2种标准品的标准曲线，并求出回归方程和相关系数。

1.4.5 数据处理。

使用药动学程序软件DAS 3.0进行各组织中药代动力学模型拟合及参数计算，药物消除的药时曲线及药物标准曲线使用Microsoft Excel 2013软件绘制，使用SPSS 13.0统计软件进行数据统计与分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线及检测限

在设定的色谱条件下，使用高效液相色谱仪测定血浆和组织中吡喹酮及其一羟基代谢物（M1）的含量，色谱图基线走动平稳，特异性强，重现性好（图1）。吡喹酮（PZQ）及M1的标准溶液在0.05～20.00 μg/mL质量浓度范围内呈线性关系，且线性关系良好，其回归方程分别为y=0.142 4x+0.104 7（R2=0.999 9）和y=0.087 6x+0.177 9（R2=0.999 9）。以引起3倍极限噪音的药量为最低检测限，该方法的最低检测限为0.05 μg/mL。

2.2 回收率和精密度

吡喹酮在草魚血浆、肝脏、肠道和肾脏内的回收率分别为81.4%～84.1%、80.8%～82.6%、85.5%～86.7%和 84.4%～85.8%，均能达到检测要求。测得的血浆和样品的日内相对标准偏差不大于5.07%，日间相对标准偏差不大于5.68%，均小于10%，符合精密度的测定要求。

2.3 吡喹酮及吡喹酮一羟基代谢产物在草鱼体内的药代动力学规律

在20 ℃水温条件下，对草鱼以10 mg/kg的剂量单次口灌吡喹酮后，吡喹酮（PZQ）及吡喹酮一羟基代谢产物（M1）在各组织中的药时曲线见图2，主要的药物代谢动力学参数见表1。吡喹酮及吡喹酮一羟基代谢产物在淡水草鱼血浆、肠道、肝脏和肾脏中符合一级吸收二室开放模型。

2.4 吡喹酮及吡喹酮一羟基代谢产物在草鱼体内的浓度及分布特征

对草鱼以10 mg/kg的剂量单次口灌吡喹酮后，吡喹酮（PZQ）及其一羟基代谢物（M1）在草鱼体内各组织的药时曲线见图2。在草鱼血浆中，PZQ和M1的达峰时间分别为1和48 h，肠道中PZQ和M1的达峰时间分别为0.5和0.5 h，肝脏中吡喹酮和M1的达峰时间分别为1和6 h，肾脏中PZQ和M1的达峰时间分别为1和48 h，说明吡喹酮代谢物的达峰时间几乎都有所延迟。从图2可以看出，草鱼血浆中M1含量较其他组织高，血浆和肾脏的M1浓度在后半段时间维持在较高水平，肠道的M1浓度在前几个时间点维持在较高水平，此后的消除规律与吡喹酮相似。

3 讨论与结论

吡喹酮在水产养殖业中主要用作杀虫剂，用于治疗鱼的寄生虫疾病。由于该药在水生生物体内吸收快、疗效好、使用方便，其应用范围被不断拓宽，正逐渐成为一种常用的鱼用杀虫剂。为了规范养殖技术，控制因乱用杀虫剂给水产品带来的食用不安全性，吡喹酮在水产品残留检测中尤为重要。笔者在20 ℃条件下以10 mg/kg的剂量对淡水草鱼单次口灌吡喹酮预混剂，对比吡喹酮及吡喹酮一羟基代谢产物的药动学差异。结果表明，吡喹酮及吡喹酮一羟基代谢产物在草鱼血浆、肌肉、肝脏和肾脏在各个时间点的药物浓度存在极显著差异（P<0.01）。

3.1 吡喹酮在草鱼体内的药动学特征

在对草鱼口灌单剂量10 mg/kg吡喹酮后，吡喹酮在鱼体内各组织的药时数据均符合一级吸收二室开放模型，其血浆、肠道、肝脏和肾脏的达峰时间分别为1.0、0.5、1.0和1.0 h，而药物峰浓度为0.41、0.45、0.72和0.44 mg/L，消除半衰期（t1/2）分别为16.41、4.77、37.16和8.74 h，表观分布容积（V1/F）分别为22.82、31.54、26.47和39.50 L/kg，说明吡喹酮在草鱼体内吸收快且分布广泛。在对草鱼口灌

单剂量10 mg/kg吡喹酮后，吡喹酮一羟基代谢物M1在鱼体血浆、肠道、肝脏、肾脏内的药时数据均符合一级吸收二室开放模型，其达峰时间分别为48.0、0.5、6.0和48.0 h，而药物峰浓度为0.72、0.45、0.42和0.42 mg/g。谢欣燕等[15]在对草鱼口灌单剂量500 mg/kg吡喹酮，草鱼血浆的药时数据符合二室模型，血浆中药物在1 h时达到峰值（1.13 μg/mL），表明吡喹酮口服后吸收迅速且分布快，在体内有效浓度维持时间较长。该试验结果与前人研究报道相一致，但是由于试验的给药剂量的不同，鱼体内的药物浓度水平也有一定差异。

3.2 吡喹酮在草鱼体内的代谢情况

曾有学者运用放射性同位素技术研究吡喹酮在人体及实验动物体内的代谢，结果发现吡喹酮会迅速被机体吸收，且大多数药物在24 h后经尿液排出，以原药形式从尿液排泄的不足口灌剂量的0.1%[16-18]。Bühring等[19]对吡喹酮在小鼠肝脏代谢后的代谢产物进行了研究，发现吡喹酮代谢后是被氧化成几种不同的羟化产物，经过质谱分析，得到其结构式。其中，一羟基代谢物（M1）的含量最高。

在对草鱼口灌单剂量10 mg/kg吡喹酮后，在草鱼血浆中，吡喹酮及M1的达峰时间分别为1和48 h，肝脏中吡喹酮及M1的达峰时间分别为1和6 h，肠道中吡喹酮及M1的达峰时间分别为0.5和0.5 h，肾脏中吡喹酮及M1的达峰时间分别为1和48 h。除肠道外，吡喹酮代谢物在其他内脏内的达峰时间都延迟，可能是因为吡喹酮在组织中代谢需要经过一段时间，而肠道里药物容易被排空，所以肠道的药物滞留时间没有其他组织长且浓度高。

吡喹酮及其代谢物在草鱼血浆、肝脏、肠道和肾脏组织中均有分布，总残留量从大到小依次为肝脏、肾脏、血浆、肠道，吡喹酮及其代谢物在肝脏中残留量最高，消除速度最慢，因此初步推断出肝脏是其残留靶组织。草鱼血浆中吡喹酮的峰浓度为0.41 μg/mL，代谢物M1的峰浓度为0.72 μg/mL，说明吡喹酮在草鱼体内代谢成M1的能力很强，除肠道外，吡喹酮一羟基代谢产物在血浆、肝脏和肾脏各组织中的残留量均大于吡喹酮。这说明吡喹酮原型药可能不是吡喹酮在鱼体内的残留标示物。

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