超声辅助提取酒糟类黑精的工艺研究

郝日礼 郑佳佳 朱传合

摘要 [目的]确定酒糟类黑精最佳超声提取工艺参数。[方法]以酒糟为原料，采用单因素试验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验及Box-Behnken设计进行超声辅助酒糟类黑精提取工艺研究。[结果]试验确定酒糟中类黑精的最佳条件为超声时间23 min、超声温度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）、超声功率540 W、颗粒直径270 μm，该条件下酒糟中类黑精的提取率为66.92%。[结论]该研究可为类黑精的开发应用提供参考。

关键词 酒糟；类黑精；超声辅助提取

中图分类号 TS261 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）06-0071-05

Optimization for Ultrasonic-assisted Extraction of Melanoidin from Vinasse

HAO Ri-li， ZHENG Jia-jia， ZHU Chuan-he*

（College of Food Science and Engineering， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018）

Abstract [Objective] The ultrasonic-assisted extraction technology of melanoidin from vinasse was optimized.[Method] With vinasse as raw material， single factor test， Plackett-Burman design（PB）， the steepest ascent method and Box-Behnken design （BB） was used to establish the optimal processing.[Result]The optimal conditions were as followed： ultrasonic treatment of 23 min， ultrasonic treatment temperature 55 ℃， pH 1.0， ratio of material and liquor 1∶29（mg∶mL）， ultrasound power 540 W and particle diameter 270 μm.The extraction rate is 66.92%.[Conclusion] The study can lay a foundation for development and application of melanoidin.

Key words Vinasse；Melanoidin；Ultrasonic-assisted extraction

酒糟作为谷物中蒸出酒精或酒精饮料后的残渣，常被作为家畜的饲料。我国白酒酿造行业每年产生大量酒糟，不仅利用率低而且带来诸多环境问题。食品类黑精是指羰基化合物与带有游离氨基的含氮化合物之间发生美拉德反应时后期形成的棕褐色大分子量聚合产物[1]。研究表明，食品类黑精具有一定的抗氧化、抗诱变、降糖、结合风味物质的作用，另外还具有类似膳食纤维的功能[2]。传统抗氧化剂因可能具致癌性被部分国家禁止使用，从天然产品中提取的类黑精可能成为安全替代品之一。白酒的高温酿造过程中羰氨反应下类黑精的生成，为酒糟类黑精的提取研究奠定了基础。

目前国内外学者已对咖啡、李子干[3]、焙烤食品[4]、豆豉[5]、蜂蜜[6-7]、奶酪[8]、酱油[9-10]、甜葡萄酒[11]等真正褐色食品体系美拉德反应类黑精及其中间体进行了提取分离以及研究，但鲜有从酒糟中提取类黑精的技术研究。笔者以芝麻香型酒糟为原料，采用超声辅助提取，通过测定清除羟基自由基的能力来确定酒糟类黑精的提取率，进而确定工艺参数，为类黑精的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要试剂。

芝麻香型酒糟由泰安生力源集团提供，60 ℃烘干、粉碎后过筛备用；乙醇、硫酸亚铁、水杨酸、双氧水等均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器设备。

UV-2450紫外分光光度计，日本岛津有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，常州市华普达教学仪器有限公司；TDZ5-WS台式低速离心机，长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司；KQ-600DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 類黑精提取率的测定。

清除羟基自由基的测定采用Fenton反应水杨酸法[12]，略有改动。

分别配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL抗坏血酸标准品标准溶液，测定其羟基自由基清除率，以羟基自由基清除率（Y）为纵坐标，抗坏血酸浓度（X）为横坐标，得标准曲线的回归方程：Y=384.06 x-5.471（R2=0.996 7）。

准确称取酒糟干粉1.000 g，置于250 mL三角瓶中，加入溶剂混匀，在不同条件下提取，3 500 r/min离心15 min，取上清液定容待测。测定样品液的羟自由基清除率，根据抗坏血酸标准曲线的回归方程，计算酒糟类黑精的提取率。

酒糟类黑精提取率（%）=C×V×100/m式中，C为按照标准曲线计算出的类黑精的抗坏血酸质量浓度（mg/mL）；V为样液体积（mL）；m为1 g酒糟完全提取时抗坏血酸的质量（g）。

1.2.2 酒糟类黑精提取工艺参数的优化。

以乙醇浓度、超声时间、超声功率、超声温度、料液比（mg∶mL）、颗粒度、pH为考察对象，采用单因素试验、Plackett-Burman（PB）试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken（BB）试验，获取最适工艺参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对类黑精提取率的影响。

在料液比1∶20、超声功率300 W、超声时间30 min、超声温度30 ℃、颗粒直径380 μm的条件下，考察不同浓度乙醇对类黑精提取率的影响。由图1可见，提取率随着乙醇浓度的增大明显减小，当采用无水乙醇提取时提取率小于5%，这可能是该物质醇溶性较低导致。因此，选择水作为提取溶剂。

2.1.2 超声时间对类黑精提取率的影响。

当料液比为1∶20、超声功率300 W、超声温度30 ℃、颗粒直径380 μm时，考察不同超声时间处理对类黑精提取率的影响。由图2可知，随着超声时间的延长，提取率呈现出上升的趋势，并且在30 min时间范围内迅速升高，在30 min后增幅变缓，趋于稳定。由此，确定超声时间为30 min。

2.1.3 料液比对类黑精提取率的影响。

在超声时间30 min、超声功率300 W、超声温度30 ℃、颗粒直径380 μm条件下，考察不同料液比对类黑精提取率的影响。由图3可知，类黑精提取率随料液比中溶剂用量的增大呈现上升趋势，但1∶25后上升趋势不明显。本着经济的原则，选择1∶25为进一步试验条件。

2.1.4 颗粒度对类黑精提取率的影响。

在料液比1∶25、超声温度30 ℃、超声时间30 min、超声功率300 W的条件下，研究不同颗粒直径（380、270、250、212、160 μm即40、50、60、70、90目）对类黑精提取率的影响。由图4可以看出，当颗粒直径小于270 μm，其对酒糟类黑精提取率的影响不显著（P<0.05），故选取颗粒直径270 μm进行后续试验。

2.1.5 超声功率对类黑精提取率的影响。

在料液比1∶25、超声温度30 ℃、超声时间30 min、颗粒直径270 μm条件下，研究不同超声功率对类黑精提取率的影响。

由图5可以看出，当功率增加时，类黑精的提取率相应增加，当功率达到540 W时出现最高值，而后有所下降。分析原因，低功率超声的空化作用对类黑精的提取有利，高功率则对其结构造成破坏。同时，比较超声处理和未超声处理（0 W）的提取率发现，浸泡提取率仅为28.2%，超声辅助提取极大地提高了类黑精提取率。

2.1.6 超声温度对类黑精提取率的影响。

在料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率540 W、颗粒直径270 μm的条件下，研究不同超声温度对类黑精提取率的影响。由图6可见，类黑精的提取率随着浸提温度的增加有所提高，在60 ℃时达到最大值，故选取60 ℃作为进一步提取温度。

2.1.7 pH对类黑精提取率的影响。

在料液比1∶25、超声时间30 min、超声功率540 W、超声温度60 ℃、颗粒直径270 μm的条件下，考察不同pH对类黑精提取率的影响。由图7可知，随着pH的提高，类黑精的提取率呈现先降低后增加的趋势。考虑到碱性环境对类黑精易造成破坏，故选择pH 2.0作为提取条件。

2.2 PB试验

根据单因素试验结果，选用n=12，中心点数为3的PB设计，对超声时间（X1）、超声温度（X2）、pH（X3）、料液比（X4）及颗粒度（X5）5个因素进行考察，试验设计见表1，结果见表2。

采用Minitab15软件对表2中试验结果进行回归方程系数显著性检验，回归模型的P<0.001（P<0.05），决定系数R2为87.75%，说明回归方程拟合良好，其显著性分析结果见表3。

表3中显著性分析表明超声时间、超声温度、pH、料液比P值均小于0.05，为影响酒糟类黑精提取率的显著因子，作为进一步考察因素；而颗粒度为不显著因子。影响显著的因素中，按其影响由大到小分别为超声时间、超声温度、pH、料液比；其中超声时间、超声温度和pH系数为负数，说明在该试验所选择的范围内响应值随其增大而减小；料液比系数为正值，表明料液比处于高水平时响应值相对较大。

2.3 最陡爬坡试验

以PB试验确定的显著因素为爬坡试验的因素，用各显著因素的正负效应确定最陡爬坡试验的路径（包括變化方向和变化步长），进行最陡爬坡试验，试验设计及结果见表4。

由表4可知，在3号试验处达到最高点，该点对应的条件值为超声时间21 min、超声温度54 ℃、pH 1.1、料液比1∶28。

2.4 BB试验

根据最陡爬坡试验结果，采用响应面设计，运用BB中心组合试验设计原理[13]，选择对酒糟类黑精提取率影响显著的4个因素，超声时间（X1）、超声温度（X2）、pH（X3）和料液比（X4）为自变量，以类黑精提取率（Y）为因变量，做4因素3水平BB试验，试验设计见表5，结果见表6。

2.4.1 参数分析。

利用SAS 8.0软件对表6中BB试验设计结果进行回归分析，并对模型系数进行显著性检验，结果得出，

FX1=25.110 01，PX1=0.000 304；

FX2=20.986 23，PX2=0.000 631；

FX3=0.002 434，PX3=0.961 464；

FX4=45.586 76，PX4=0.000 1；

FX21=29.577 89，PX21=0.000 15；

FX1X2=2.254 442，PX1X2=0.159 079；

FX1X3=5.493 276，PX1X3=0.037 13；

FX1X4=4.408 449，PX1X4=0.057 583；

FX22=34.108 88，PX22=0.000 1；

FX2X3=0.838 207，PX2X3=0.377 941；

FX2X4=0.005 365，PX2X4=0.942 82；

FX23=23.763 01，PX23=0.000 382；

FX3X4=5.379 429，PX3X4=0.038 812；

FX24=11.958 61，PX24=0.004 734；

F模型=11.644 47，P模型=0.000 1；

F线性=22.921 36，P线性=0.000 1；

F二次项=13.239 49，P二次项=0.000 234；

F交叉乘积=3.063 195，P交叉乘积=0.046 786；

F失拟项=15.992 16，P失拟项=0.060 251。

由此表明二次多项式具有高度的显著性；失拟项P=0.060 251>0.05，不显著；CV=0.631 825<10；同时，模型的R2=93.14%，表明试验数据与回归数学模型拟合性良好[14]，上述模型可较好地预测各指标实际值。

根据P值检验各模型系数的显著性，同时也可反映变量之间交互作用大小，P值越小越显著。表明，一次项和二次项对提取率的影响极显著（P<0.01），交互项显著（P<0.05）。超声时间（X1）、超声温度（X2）和料液比（X4）对酒糟类黑精的线性效应皆极显著，pH（X3）不显著；各因素影响由大到小分别是：料液比（X4）、超声时间（X1）、超声温度（X2）、pH（X3）。交互项中X1X3、X3X4影响显著（P<0.05），X1X2、X1X4、X2X3、X2X4均不显著。

2.4.2 参数优化。

在对类黑精提取率回归模型的建立及检验对各因素回归拟合后，得到回归方程：

Y=66.373 33+0.592 5X1+0.541 667X2-0.005 833X3+0.798 333X4-0.964 583X21-0.307 5X1X2-0.48X1X3+0.43X1X4-1.035 833X22-0.187 5X2X3+0.015X2X4-0.864 583X23-0.475X3X4-0.613 333X24。

利用该回归方程确定，编码值为x1=0.633 587，x2=0.220 084，x3=-0.496 450，x4=1.067 846；此时响应值达到最大稳定预测值67.048 34。将上述编码值进行转化，并结合情况确定酒糟类黑精最佳提取工艺：超声时间23 min、超声温度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）。在此条件下进行验证试验，3次平行试验类黑精提取率为（66.92±0.226）%，与预测值较为接近，说明回归方程能够比较真实地反映各因素对类黑精提取率的影响，得到的酒糟类黑精提取条件具有实际应用价值。

3 结论

该试验通过未超声和超声辅助提取的类黑精提取率比较，结果显示，超声辅助提取能够显著提高酒糟类黑精提取率。在BB试验选择范围内，pH、超声时间、超声温度和料液比为影响超声辅助酒糟类黑精提取率的显著因素，其影响由大到小分别是：料液比、超声温度、超声时间及pH。超声辅助酒糟类黑精最佳提取工艺：超声时间23 min、超声温度55 ℃、pH 1.0、料液比1∶29（mg∶mL）、超声功率540 W、颗粒直径270 μm。

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