柠条锦鸡儿獸3H基因克隆及功能分析

郑晟 毛玉珊 张腾国 聂亭亭

摘要： 柠条锦鸡儿为豆科灌木，对各种环境胁迫具有较强的适应能力，类黄酮是天然的抗氧化剂，花青素属类黄酮化合物，逆境胁迫会影响植物体内花青素的合成，而黄烷酮3羟化酶 （F3H） 是花青素生物合成所必需的一种关键酶。该研究成功分离克隆了柠条锦鸡儿的F3H基因，命名为CkF3H。CkF3H基因的开放阅读框 （ORF） 为1 095 bp，编码364个氨基酸，推测的蛋白质分子量为41.3 kDa，理论等电点为5.9。生物信息学分析发现，CkF3H基因序列与其它植物F3H有较高的一致性，推测CkF3H蛋白与其它植物F3H蛋白具有相似的功能。利用染色体步移法克隆得到CkF3H起始密码子ATG上游468 bp的启动子序列，PlantCARE软件分析表明，该序列具有启动子的基本元件CAATbox和TATAbox以及多种与逆境胁迫相关的顺式调控元件。实时荧光定量PCR分析表明，CkF3H在柠条的根、茎和叶中均有表达，没有组织特异性；CkF3H的表达受低温、高盐、干旱和高温胁迫的诱导，并且在低温胁迫下，CkF3H的表达还受到光周期的影响。综上所述，研究结果表明CkF3H基因在柠条锦鸡儿适应低温、高盐、干旱和高温胁迫的过程中发挥作用。

关键词： 柠条锦鸡儿， CkF3H基因， 基因克隆， 表达分析， 非生物胁迫

中图分类号： Q943.2

文献标识码： A

文章编号： 10003142（2017）06072311

Abstract： Caragana korshinskii is a kind of shrub belonging to the leguminosae category and it has characteristic of tolerance to stressful conditions. Flavonoids are natural antioxidants that include the groups of notable pigments such as anthocyanins. The adversity stress can influence the biosynthesis of anthocyanins in plants. Flavanone 3Hydroxylase （F3H） is a key enzyme needed for the biosynthesis of anthocyanins. In this study， we successfully isolated， cloned F3H gene from C. korshinskii. The full length cDNA of C. korshinskii F3H gene （designated as CkF3H） had an open reading frame （ORF） of 1 095 bp encoding 364 amino acids with a calculated molecular mass of 41.3 kDa as well as an isoelectric point of 5.9. Comparative and bioinformatical analyses revealed that the cloned CkF3H from C. korshinskii has high identity with F3H from other plant species. The deduced CkF3H protein showed similarities with other available plant F3H proteins. The promoter of CkF3H gene was isolated by chromosomal walking and 468 bp sequence was obtained by sequencing. PlantCARE analysis of this sequence showed that the peomoter contained some typical elements CAATbox and TATAbox and kinds of Cisacting elements involved in defence and stress responsiveness. RTPCR analysis revealed that CkF3H was expressed in roots， stems， and leaves with almost no tissue specificity. The transcript level of CkF3H was increased in response to cold， high salt， drought and high temperature stress. The gene expression of CkF3H was influenced by photoperiod in response to cold stresses. The results suggested that CkF3H played an important role during cold， high salt， drought and high temperature stress in C. korshinskii.

Key words： Caragana korshinskii， CkF3H gene， gene cloning， expression analysis， abiotic stress

類黄酮（又称黄酮类物质）是一类广泛分布于高等植物中的多酚类次生代谢产物，是存在于植物中的天然色素（Shirley， 1996）。在植物适应特殊生境以及响应生物与非生物胁迫时，类黄酮发挥重要的作用。在植物体内，类黄酮主要以糖基衍生物的形式存在，是植物花、叶、果实和种子的主要显色物质，同时，类黄酮在植物体内也具有很重要的功能。类黄酮具有清除自由基和抗氧化的能力（Jovanovic et al， 1994），此外，类黄酮在人体中也具有多种生物活性，如抗氧化、抗病毒、血管舒张活性、抗癌和防衰老（Pietta， 2000； Heim et al， 2002）。

花青素（Anthocyanidin）为类黄酮化合物，是一种水溶性天然色素，广泛存于自然界的植物中（Sarma et al， 1997）。花青素生物合成途径是黄酮类代谢途径中的一个分支途径，苯丙氨酸是其生物合成的直接前体，经一系列酶促反应合成花青素。由苯丙氨酸合成花青素主要过程如下：苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）作用下脱去氨基，形成肉桂酸；在肉桂酸羟化酶（C4H）的作用下羟基化，形成4香豆酸；在4香豆酸CoA连接酶（4CL）的作用下，形成4香豆酰CoA；4香豆酰CoA和丙二酰CoA在查尔酮合酶（CHS）的催化下合成查尔酮；由查尔酮异构酶（CHI）将其转变成4，5，7三氢黄烷酮；4，5，7三氢黄烷酮在黄烷酮3羟化酶（F3H）的催化下形成二氢黄酮醇，这一阶段产生的二氢黄酮醇可在不同酶的作用下转化为花青素或其它类黄酮物质（二氢榭皮素和二氢杨梅黄酮等）（Holton & Cornish， 1995； WinkelShirley， 2001）。

黄烷酮3羟化酶（flavanone 3 hydroxylase，F3H）基因最早由Martin et al（1991）从金鱼草中分离得到。对矮牵牛的研究表明，F3H是分子量为42 kD的单体蛋白，在这其中His220、His278、Arg222及Ser290氨基酸残基对酶活起到了关键作用（Lukacin & Britsch， 1997）。研究发现，F3H基因在拟南芥、矮牵牛、玉米及苜蓿等多种植物中以单拷贝基因的形式存在，而在紫苏中存在2～3个拷贝（Gong et al， 1997）。张华玲等（2010）克隆得到苦荞F3H基因，并对其进行进行序列分析。结果表明，FtF3H基因长1 369 bp，编码367个氨基酸，与葡萄、牵牛F3H的同源性达到80%左右。预测的FtF3H蛋白具有铁离子结合位点及2酮戊二酸结合位点等典型结构。采用电子克隆法，获得了红花菜豆F3H基因的cDNA编码序列，并采用生物信息工具对红花菜豆F3H基因的性质进行研究。结果表明，红花菜豆F3H基因开放阅读框为2 228 bp，编码375个氨基酸，与大豆F3H基因同源性为92% （Ma & Guo， 2014）。F3H基因在花青素合成及环境胁迫中发挥着重要作用。研究表明，阻断拟南芥F3H基因表达能导致黄酮及花色素水平下降（Wisman et al， 1998）。红砂在干旱和紫外线辐射胁迫中，F3H基因的表达量显著上升，酶活性增强，植物花青素含量和抗氧化能力增强（Liu et al， 2013）。盐胁迫下，F3H基因在茶和转基因烟草中的表达量及酶活性都显著增加（Mahajan & Yadav， 2014）。此外，枸杞F3H基因在转基因烟草中过表达能够增强其对干旱胁迫的耐受性（Song et al， 2016）。由此可见，当植物受到逆境胁迫时，F3H促进花青素的积累，增强抗氧化能力，从而抵御逆境。目前已陆续从拟南芥、矮牵牛、玉米、甘蓝型油菜、苜蓿、苹果、康乃馨、銀杏及苦荞等多种植物中克隆得到F3H基因，但在柠条锦鸡儿中未见报道。

柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii）为豆科锦鸡儿属的灌木类植物，具有较为发达的根系。主要生长于内蒙古西部、陕西北部、宁夏及甘肃（河西走廊）等地区 （李高等， 2013），生于半固定和固定沙地，是黄土高原植被建设的优良灌木植物。柠条锦鸡儿具有广泛的适应性和很强的抗逆性，能耐低温及酷热，也具有很强的抗旱能力，是荒漠、荒漠草原地带的优质防风固沙的植物。另外，柠条锦鸡儿是优良的可再生生物能源，它枝叶繁茂，产草量高，茎叶营养丰富，是畜牧业优良的灌木饲料，还具有抗风、不怕埋没等特点 （刘龙会等， 2012； 杨杞等， 2013）。近年来，关于柠条锦鸡儿的研究已受到人们越来越多的关注，选择柠条锦鸡儿为实验材料，为我们的研究提供了更多可能性。

本研究以柠条锦鸡儿为研究对象，从中克隆F3H基因，对F3H基因进行生物信息学分析，在不同的逆境处理下检测F3H基因mRNA转录水平的变化，分析其在不同胁迫下的基因表达量，并克隆该基因的启动子，对其启动子的功能区进行分析，为研究F3H基因及花青素在逆境胁迫下的作用机制提供参考。

1材料与方法

1.1 材料与培养处理

以柠条锦鸡儿（Caragana korshinskii）为材料。于1/2 MS培养基中培养约45 d备用。培养条件：25 ℃，光周期16 h光照/8 h黑暗，光照强度130 μmol·m2·s1。

低温处理：将柠条锦鸡儿放入4 ℃培养箱中分别处理0、12、24、36和48 h，光周期为16 h光照/8 h黑暗，处理时0 h开始先光照；盐处理：在NaCl浓度为0、50、100、150和200 mmol·L1的培养液中分别处理柠条锦鸡儿植株24 h；干旱处理：在PEG6000质量分数为5%、10%、15%和20%的培养液中分别处理柠条锦鸡儿植株48 h；高温处理：将柠条锦鸡儿植株分别置于25、30、35、38和40 ℃培养条件下培养6 h。

本研究所用菌株为E.coli DH5α，克隆载体为pTG19T。引物合成及测序服务均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 柠条锦鸡儿总RNA提取及反转录选取生长良好的柠条锦鸡儿植株，按照Trizol（上海生工生物公司）说明书进行总RNA的提取。总RNA经过纯度检测后，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（TakaRa）试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA。

1.2.2 RACE方法克隆柠条锦鸡儿F3H基因cDNA全长柠条锦鸡儿F3H基因中间保守片段克隆：从GenBank中下载已克隆得到的植物F3H基因序列，用DNAstar软件MegAlign模块进行序列比对，根据比对结果，设计简并性引物Primer 1和Primer 2，Primer 3和Primer 4（表1）。以反转录得到的柠条锦鸡儿cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物凝胶回收，连入pTG19T载体，4 ℃过夜连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃过夜培养，蓝白斑筛选后挑取白斑进行菌液PCR检测，挑选阳性克隆，送北京六合华大基因有限公司测序。

柠条锦鸡儿F3H基因3′RACE克隆：提取柠条总RNA，按照3′Full RACE Core Set Ver.2.0（TakaRa）试剂盒说明书进行反转录及3′RACE扩增反应。以试剂盒中提供的两个特异性引物3′RACE D1和3′RACE D2（表1）为下游引物，根据扩增得到的柠条锦鸡儿F3H中间片段序列，设计3′RACE扩增上游引物3′RACE U1和 3′RACE U2（表1）。以反转录得到的cDNA为模板，3′RACE U1，3′RACE D1为引物进行第一次PCR扩增，以一扩产物为模板， 3′RACE U2，3′RACE D2為引物进行第二次PCR扩增，得到预期大小的片段，切胶回收，连接pTG19T载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆测序。

柠条锦鸡儿F3H基因的5′RACE克隆：提取柠条锦鸡儿总RNA，按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0（TakaRa）的说明书进行反转录及5′RACE扩增反应。以试剂盒中提供的两个特异性引物5′RACE U1和 5′RACE U2（表1）为上游引物，根据扩增得到的柠条锦鸡儿F3H中间片段序列，设计5′RACE扩增下游引物5′RACE D1和5′RACE D2（表1）。5′RACE U1和5′RACE D1为引物进行一次PCR扩增，再以一扩产物为模板，以5′RACE U2和5′RACE D2为引物进行二次PCR扩增，得到预期大小的片段，切胶回收，连接pTG19T载体，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆测序。

根据柠条锦鸡儿F3H基因RACE测序结果与之前得到的中间片段进行拼接，得到全长基因，设计引物扩增F3H基因的全长，以验证得到的序列是否正确。PCR产物纯化回收后，连接载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37 ℃过夜培养，蓝白筛选阳性克隆，送华大基因公司测序。

1.2.3 实时荧光定量PCR以反转录得到的cDNA为模板，以ActinF，ActinR为管家基因引物， F3HDL U，F3HDL D为目的基因引物（表1），对柠条锦鸡儿F3H基因的表达量进行分析。按照SYBR Premix Ex Taq TM（TakaRa）操作说明书于25 μL反应体系进行PCR扩增， 每个样品做3个平行重复， 每

一种胁迫处理做3次生物学重复。

反应体系如下：SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL，F3HDL U、F3HDL D或ActinF、ActinR （10 μmol·L1）各1 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环；55～95 ℃每30 s渐进升高0.5 ℃，81个循环。扩增结束后，采用2-△△Ct法分析数据，确定基因的相对表达量。

1.2.4 克隆柠条锦鸡儿F3H基因启动子选取生长良好的柠条锦鸡儿植株，用Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0（TakaRa）试剂盒提取其幼嫩叶片中的基因组DNA，根据已知的柠条锦鸡儿F3H基因全长序列设计特异性引物，按照Genome Walking Kit（TakaRa）试剂盒克隆CkF3H基因的启动子序列。根据染色体步移的测序结果及CkF3H基因的全长序列设计一对基因特异性引物，以基因组DNA为模板，按照Premix Ex Taq DNA Polymerase（TakaRa）说明书进行PCR扩增，进一步验证启动子克隆的正确性。

1.2.5 柠条锦鸡儿F3H基因的生物信息学分析用DNAstar软件的Protean模块对柠条锦鸡儿F3H基因进行氨基酸组成成分和蛋白基本特征分析，用Clustal方法构建以氨基酸序列为基础的系统进化树；用在线工具SOPMA预测柠条锦鸡儿 F3H蛋白的二级结构；根据生物信息学软件TopPred （http：//services.cbib.Ubordeaux2.fr/pise/Toppred.htm1）、TMHMM （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM2.0/）、SOSUI （http：//bp.nuap.nagoyau.ac.jp/sosui/） 在线分析柠条锦鸡儿F3H蛋白的亲水/疏水性以及跨膜结构域。用在线分析软件PlantCARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析柠条锦鸡儿F3H基因启动子序列，根据启动子序列中所含的功能元件预测启动子的功能。

2结果与分析

2.1 CkF3H基因的克隆

利用已经克隆报道的植物F3H基因序列，通过分析在其保守区设计两对简并引物，从柠条锦鸡儿叶片中提取总RNA，并以其反转录的cDNA为模板，扩增得到500 bp和400 bp左右的两条单一条带（图1：A）。将这两个基因片段经测序后拼接得到一条长度为760 bp的中间片段。再通过3′RACE和5′RACE分别扩增得到530 bp与400 bp大小的基因片段（图1：B， C），经过测序后发现，与前面扩增得到的中间片段核苷酸序列有完全一致的重叠部分，说明以上克隆得到的片段均属于同一条基因。

将扩增得到的中间片段以及3′RACE和5′RACE扩增得到的片段序列进行拼接，得到了一条全长1 437 bp的基因序列（图2），包含一个1 095 bp的开放阅读框（ORF），编码364个氨基酸。起始密码子ATG前面有一段115 bp的5′非翻译区（5′UTR），终止密码子TAG后面有一段227 bp的3′非翻译区（3′UTR），包含15 bp的polyA。为了进一步确定以上拼接序列的正确性，我们用特异引物对全长序列进行了扩增克隆，经比对与拼接序列的核苷酸组成完全相同。

与GenBank数据库中的序列进行比对，该片段与其它物种F3H基因的序列相似性为73%～89%，由此可以确定获得的该序列片段属于柠条锦鸡儿中的F3H基因，我们命名为CkF3H。

2.2 CkF3H预测氨基酸序列与其他植物氨基酸序列比对分析

根据得到的CkF3H基因全长序列，利用Vised11软件推导其氨基酸序列（图2）。通过SOPMA对柠条锦鸡儿F3H预测蛋白的二级结构进行预测，结果显示：其蛋白包含37.09%的α螺旋（Alpha helix）、22.8%的延伸链（Extended strand）、11.26%的β转角（Beta turn）和28.85%的无规则卷曲（Random coil）。

从Genbank中下载已经克隆得到的植物F3H基因序列，利用ClustalX 2.1软件对柠条锦鸡儿、红豆草、蒺藜苜蓿、大豆、鹰嘴豆、烟草、拟南芥、玉米F3H基因编码的氨基酸序列进行比对（图3）。进一步分析发现，CkF3H与红豆草OvF3H同源性最高，达到了89.3%，与蒺藜苜蓿MtF3H，大豆GmF3H，鹰嘴豆CaF3H，棉花GhF3H，兔眼蓝莓VaF3H，拟南芥AtF3H的同源性分别为85.8%，85.0%，83.9%，79.3%，78.1%，73.6%。同时，利用MEGA 5.02软件，对已报道的部分F3H蛋白进行了聚类分析，构建了F3H基因的系统进化树（图4）。

2.3 CkF3H基因启动子的克隆及分析

以柠条锦鸡儿中提取到的总DNA为模板，进行巢式PCR扩增，经过第3次PCR扩增后在600 bp处有一明显条带（图5），回收后測序。结果表明，成

功克隆得到了CkF3H基因起始密码子ATG上游启动子序列468 bp。采用PlantCARE软件进行基础启动子区及调控元件分析（图6），发现该序列具有启动子基本元件CAATbox和TATAbox。三个高水平转录调控因子5′UTR嘧啶密集区5UTR Pyrich stretch，分别位于-506 bp、-508 bp、-510 bp处。一个与缺氧有道相关的元件ARE，位于+178 bp处。一个光反应元件ATCTmotif、BoxI、BoxIII、Gbox、两个Sp1，分别位于-36 bp、-261 bp、+382 bp、-257 bp、+229 bp和+302 bp。一个真菌诱导应答元件BoxW1，位于+298 bp。两个分生组织特意表达调控元件CCGTCCbox，分别位于+460 bp和-603 bp。一个与Me Ja和ABA等激素响应相关的作用元件CGTCAmotif， 位于+422 bp处。一个胚乳中特意表达所需的正调控元件GCN4motif，位于-49 bp 处。一个与高温胁迫相关的调控元件HSE，位于+263 bp处。一个赤霉素应答元件Pbox，位于+258 bp处。一个激素敏感型顺式作用元件TGAelement，位于-438 bp处。一个茉莉酸甲酯作用元件，位于-422 bp处。一个WRKY转录因子结合位点W box，位于+298 bp处。此外，通过软件分析还发现该启动子还具有Cbox，MNF1等高效作用元件。

2.4 CkF3H基因表达分析

以柠条锦鸡儿根、茎和叶中提取的mRNA反转录得到的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，分析CkF3H基因在不同组织的表达。结果表明，CkF3H基因在柠条锦鸡儿的根、茎、叶中均有表达，没有组织特异性（图7）在叶片中表达量最高，其次是茎和根。

通过在4 ℃低温处理我们发现，CkF3H基因的表达受低温胁迫诱导。将柠条锦鸡儿植株在4 ℃处理12、24、36和48 h后，CkF3H基因转录水平与对照（0 h）相比，分别提高了25.81、7.62、52.71和23.75倍（图8）。CkF3H基因的表达量呈现先上升后下降的趋势，在4 ℃处理36 h达到最大，转录水平最高。

通过盐胁迫处理我们发现，CkF3H基因的表达也受高浓度NaCl的诱导。当培养基中NaCl浓度为50、100、150和200 mmol·L1时，CkF3H基因的表达与对照相比，分别提高了2.53、4.06、4.86和3.51倍，其表达呈先上升后下降的趋势。当NaCl浓度为150 mmol·L1时，CkF3H基因的转录水平达到最大值，表达最强 （图9）。

通过模拟干旱胁迫我们发现，培养基中添加5%、10%、15%和20%的PEG6000后，CkF3H基因转录水平与对照相比，分别提高了2.62、28.25、52.35和22.94倍，其表达量也呈现先升高后下降的趋势，在PEG6000质量分数为15%时达到最高 （图10）。说明CkF3H基因在适应干旱胁迫的过程中发挥作用。

通过高温胁迫处理我们发现，CkF3H基因转录水平的表达也受高温诱导。将柠条植株在30、35、38和40 ℃的处理下，CkF3H基因的转录水平与对照相比，分别上升了76.64、34.3、37.27和89.26倍 （图11），在40 ℃时，CkF3H基因的转录水平达到最大。以上结果表明CkF3H基因对高温胁迫的诱导较为敏感。

3讨论

黄酮类苯环上的羟基是具有抗氧化活性的关键基团，对氧自由基有很强的清除作用（郭春梅等， 2012； 陈季武等， 2002）。当植物处于逆境胁迫时，它可将自身的氢供给脂类化合物的自由基，抑制脂类的进一步氧化，从而减少膜质损伤。黄烷酮3羟化酶（F3H）是重要的生物合成中间产物酶，参与黄酮醇、儿茶酚、花青素以及原花青素的生物合成（Prescott & John， 1996）。研究表明，生物胁迫与非生物胁迫能够诱导F3H基因的表达（Jeong et al， 2004）。在干旱、高盐、低温以及激素胁迫下，F3H基因的表达均有上升（Shinozaki & YamaguchiShinozaki， 1996）。许志茹等（2008）对芜菁F3H在UVA诱导下的表达量进行分析，发现F3H基因的表达量与UVA处理的时间呈相关性。范敏等（2008）研究表明，马铃薯F3H基因的表达量在不同干旱胁迫下都有不同程度的增加，且叶中F3H基因受干旱诱导的时间比根中长，说明F3H基因参与了马铃薯的抗旱反应。

本研究从柠条锦鸡儿中克隆了CkF3H基因，并分析了在逆境胁迫下其转录水平表达量的变化：在低温、高盐以及干旱胁迫下，CkF3H基因的表达量均呈现先升高后下降趋势，且均高于对照水平。由此可见，CkF3H基因在柠条锦鸡儿抵御低温、高盐和干旱胁迫过程中发挥了重要作用。其中，在低温胁迫处理下，CkF3H基因在0、24、48 h时表达较低，12、36 h的表达量较高，可能受到光周期的影响 （图8）；先前研究发现，在光处理条件下葡萄皮中F3H基因表达以及花青素含量均显著高于黑暗处理（Azuma et al， 2012），将苹果从暗处转移至光照条件下，其表皮中F3H基因表达显著上调（Feng et al， 2013）。因此，在低温胁迫下，CkF3H基因表达可能受低温及光照共同影响。此外，对CkF3H基因启动子区进行生物信息学分析发现：其启动子含有与光、ABA及高温等胁迫诱导相关的顺势作用元件。CkF3H基因在转录水平表达量的变化也表明了该基因受高温的诱导，且温度越高，表达量变化越明显。由于类黄酮在植物营养及生理方面具有重要作用，因此，了解类黄酮代谢途径是非常必要的。克隆分析编码此途径中关键酶的基因，是认识类黄酮生物合成调控机制的重要途径，也是进一步了解类黄酮生物学意义的基础。

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