光甘草定对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影响

赵伟 宋歌

摘要：本试验对金葡菌进行培养并加入药物观察来测定影响因子。分光光度计的测定数据表明，不同浓度的光甘草定对金黄色葡萄球菌均有一定的抑制作用。

关键词：金黄色葡萄球菌；生物被膜；光甘草定；分光光度计

中图分类号：S859.2 文献标识码：B 文章编号：2096-3637（2017）07-0006-03

和很多的致病菌一样，金黄色葡萄球菌也可以在其表面形成一层生物被膜，金黄色葡萄球菌的生物被膜形成以后，其形态特征，以及生理变化都会发生很复杂的变化，生物被膜由很多大分子物质组成，它能使包裹在内部的细菌免受外界不良环境的干扰和破坏，从而对细菌起到保护作用[1]。所以，要想防治或者治疗金黄色葡萄球菌的感染，就要先从生物被膜入手。

1金葡菌生物膜系统简介

金黄色葡萄球菌之所以难以防治，难以治疗，是因为在感染金黄色葡萄球菌以后，病菌会形成一个复杂细菌生物被膜。细菌生物被膜是一层包裹在细菌外面的极其复杂和严密的膜[2]。实验数据表明，在生物膜的形成起始阶段，细菌与细菌的粘附是生物膜形成的关键，这个阶段很大程度上受到胞外DNA（eDNA）作用和影响。在聚集阶段发挥作用的是多糖PIA[3]。PIA不仅能够诱导细菌之间相互依附粘连，还能促进细菌的分化增值，有此形成多层的细胞团块，进而形成生物被膜[4]。

基因ica操纵子是细胞间多糖粘附素合成的基础。它有五个基因串联组成，分别是icaA，icaD，icaB，icaC，icaR。其中发挥最重要作用的是icaA[5]。胞外DNA能够促进生物被膜的形成，细胞质水解酶可以通过裂解细菌将胞外DNA释放到细菌外界加强生物被膜的形成。并且细胞质水解酶受cidA的调控，所以cidA间接的对生物被膜的形成发挥重要的作用。然而如果cidA基因缺失，就会降低细菌的裂解，进而减少胞外DNA的释放，间接的对生物被膜的形成起到抑制作用。由此可见，胞外DNA是否能够释放，很大程度上取决于cidA的调节。从另一方面来说，基因cid操纵子和ica操纵子都受到agr和sar两个调节系统的影响[6]。由此，agr和sar是金葡菌研究中最重要的研究系统。实验表明，agr和sar系统可以通过影响cid的表达来控制细菌自溶，通过调控ica来影响生物膜的形成。

要想控制或抑制生物被膜，首先要做的是對生物被膜形成的研究和分析。近年对于生物被膜的研究，大多是通过改变不同环境或药物对生物被膜的作用，然后对生物被膜进行测定，通过得到的数据进行结果分析讨论，从而得出对生物被膜形成影响最大的因素，进而探测生物被膜形成的机理。在金黄色葡萄球菌生物被膜研究的实验中，通过甲基葡萄糖的研究[7]说明生物被膜的主要组成是多糖PIA，而且PIA的合成，受细菌总糖量的影响。对于金黄的葡萄球菌的治疗和防治，要从生物被膜开发，寻求的药物也需要以对PIA和eDNA有影响为基本要素。在近年的实验进程中，甘草系列的研究发展迅速，并且可能满足影响的条件，本实验旨在检验光甘草定对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的影響[8]。

2研究的目的和意义

本实验将光甘草定等样品溶于PBS溶液制成液体药物，加入到具有相同状态金黄色葡萄细菌的96孔细胞培养板内，制备成不同终浓度（有空白对照）的液体进行孵育作用，作用结束后用结晶紫染色，用分光光度计测出各孔的吸光度，从数据的不同反映出药物对金黄色葡萄球菌生物膜的影响。进一步探索光甘草定在治疗药物研发上的应用，为人类身体健康和食品安全方面的发展做出贡献。

3材料与方法

3.1材料

3.1.1材料来源

金黄色葡萄球菌和光甘草定样品。

3.1.2试验所用器材及仪器

96孔细胞培养板、火柴、平皿若干、1.5mlEP管若干、10ul枪头若干、200ul枪头若干、1ml枪头若干、1.5mlEP管架若干、细菌培养瓶若干、大小瓶塞若干、酒精灯、电磁炉、剪刀、镊子、接种环、锥形瓶若干、量筒、250ml试剂瓶若干、100ml试剂瓶若干、数码鼓风干燥箱（GZX-9070MBE上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、医用净化工作台（苏州净化设备公司）、CO2培养箱（青岛龙杰仪器公司）、数码电热恒温培养箱（HPX-9082ME上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、恒温摇床、高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、微量移液器一套（规格：0.5～10?l、20～200?l、100～1000?l，购自大龙医疗设备有限公司）、电子天平（购于北京赛多利斯天平有限公司）、离心机、酶标仪、离心管、一次性手套，-20℃冰箱、4℃冰箱、医用胶带、脱脂棉、封口薄膜等。

3.1.3试验所用试剂

胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（购自美国BD公司）、琼脂粉（北京双旋微生物培养基制品厂）、革兰氏染色剂（草酸铵结晶紫，碘液，95%酒精，石碳酸复红）、香柏油、二甲苯、蒸馏水、自来水、75%医用酒精、新洁尔灭消毒液、无水乙醇、PBS液（河南科技大学实验室制备）、苯酚、结晶紫溶液、氯仿、TEN缓冲液、异戊醇LB、EDTA、醋酸钠、液体培养基（河南科技大学制备）等。

3.2主要试剂的配制液

3.2.1 10mg/ml光甘草定溶液：PBS液3ml，加0.03g光甘草定震荡溶解。

3.2.2 LB培养液：LB液100ml，蛋白胨1g，酵母0.5g，Nacl1g。

3.2.3结晶紫溶液：结晶紫0.04g，蒸馏水10ml震荡溶解。

3.2.4 EDTA。

3.2.5 TEN缓冲液。

3.3实验设计

3.3.1检测eDNA的方法

按上述方法培养生物膜，用酶标仪检测OD600下细菌浓度，按Rice等人（2007）的方法提取并检测eDNA。加入0.5MEDTA预冷1h；用700μl50mMTEN缓冲液（Tris-HCl，10mMEDTA，500mMNaCl）重悬生物膜，转入预冷的离心管中，4℃，18000rpm离心5min；将上清转入新的离心管，加入300μlTE缓冲液，加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）；4℃，12000rpm离心10min，取上清，用氯仿∶异戊醇（24∶1）再次萃取；取水相，加入3倍体积的冷乙醇和1/10体积的醋酸钠，混匀后-20℃过夜；4℃，18000rpm离心20min，去上清，用70%冷乙醇洗涤，空气中风干后，加入20μlTE缓冲液溶解；用NanoDrop2000分光光度计检测A260/A280的吸光度比，eDNA的相对表达量用单位生物膜内eDNA的含量表示。

3.3.2甘草测定的方法

①用PBS将光甘草定配制成浓度为10mg/ml。

②将金黄色葡萄球菌接种与LB培养基37℃震荡过夜第二天取培养液用LB培养液稀释10稀释后，取200μL稀释后的菌液加入96孔细胞培养板，放于CO2培养箱培养48h。

③往96孔细胞培养板加入光甘草定终浓度为10μL/ml，20μL/ml，50μL/ml，100μL/ml，200μL/ml同时做空白对照孔，每孔重复2次，分别作用，2h，4h，6h和8h后用PBS洗去浮游菌，洗3次，加入0.04%结晶紫染色30min，用自来水洗去浮色，待膜干后，每孔用200μL乙醇溶解，于570～590nm波长下检测。

3.3.3病菌接种

把超净工作台的紫外灯打开放入试管，菌（液体）、LB液体培养基，消毒灭菌20～30min、然后，点燃酒精灯，在酒精灯旁完成实验，消毒灼烧空试管口，消毒培养液瓶口、到入1/3左右，打开装菌种的离心管、用接种环灼烧消毒，沾菌、加入试管、灼烧用过的接菌环、试管盖上纸盖子封口，用报纸包好，放入THZ-92C气浴恒温震荡器过夜（37℃12h），整理超净工作台。

3.3.4细菌的稀释

将复苏好的细菌从恒温摇床培养箱内取出，观察小试管内的细菌的情况，细菌的形态，色泽，透明度等，在净化操作台中，取锥形瓶加入3ml菌液。再加入27mlLB培养液，用200μL移液器加入到96孔细胞培养板内，培养48h。

3.3.5封口保藏

将加入了200μL稀释菌液的96孔板，用保鲜膜缠绕，确保96孔板上下两个半壳之间的空隙被密封，在底部放置湿润的毛巾，置于特定的容器内，放在二氧化碳培养箱内，培养48h。

4结果及分析

4.1 eDNA测定的结果

将作用2h的实验板经过实验处理，然后测定其数据取平均值和标准差，并做出最溶度增大的数据柱状图，作图如下：

4.2甘草作用的结果

将生物膜用结晶紫试剂染色以后，对样本进行处理完成，放入分光光度计中进行测定，测定后，求相同时间同一浓度数据的平均值和标准差，作出柱状图如下：

4.3分析

4.3.1 eDNA的测定

eDNA的相对表达量就是对金黄色葡萄球菌生物被膜形成多少的直接反映。所以从图（1）的变化可以看出，数据逐渐减小，说明同一作用时间，随着作用浓度的增大，光甘草定对金葡菌的抑制作用也在增强。

4.3.2光甘草定图（2）

光甘草定实验板的测定数据有明显的浮动和变化，说明随着光甘草定的浓度的不同，实验数据明显在减小，柱状图也在平稳的下降，实验表明光甘草定对金黄色葡萄球菌的形成有明显的抑制作用，并且随着光甘草定的浓度的增大，金黄色葡萄球菌受抑制的作用就更加明显。随着时间的延长，抑制效果也在增强。光甘草定岁生物被膜的影响机理可能是光甘草定的抗菌抗癌作用。柱状图越来越低是因为随着浓度的增加细菌受到的影响作用也越来越大，生物被膜的形成越来越少。因此实验表明，光甘草定对金黄色葡萄球菌的形成有明显的抑制作用。

5讨论

甘草是一种有益的中草药，味甘，性缓。用于很多疾病的防治和治療。而且分布广泛。在我国分布在新疆宁夏等地区。甘草是天然活性物质，能够增强人体免疫力，对炎症，肿瘤等疾病具有不同程度的防治和治疗效果。在修复自身免疫方面和抗病毒方面也有一定的效果。

经过实验，任何实验浓度的光甘草定均表现出的是对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用。通过数据的平稳降低和曲线的持续下降，表明光甘草定对生物被膜有持续的影响作用，并且还随着浓度的增加，抑制作用还越来越强。进过近年的实验研究成果观察，抑制的机理可能是影响可细菌的生长。有实验证明[9]，光甘草定对酪氨酸酶的活性有一定的影响作用。因此有可能是在细菌的新陈代谢阶段，某一种或者某几种酶活性受到干扰，导致细菌生长受阻，因此生物被膜的形成被影响。也有可能是的结构到破坏。导致细菌无法完成特定的生理过程，因此无法完成正常的生物被膜的构建。也有很多实验证明光甘草定具有一定程度的抗菌和抗癌作用。因此光甘草定可能还有其他的影响生物被膜形成的机理。

6结论

光甘草定，10～200μL/ml浓度梯度的光甘草定，随着浓度的增加对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用增强。随着作用时间延长，抑制作用增强。

参考文献

[1]陈秋云，韩北忠，李春雷，金黄色葡萄球菌生物被膜在不锈钢表面的形成及其对二氧化氯的敏感性[J]，中国农业大学学报，2004，9：10-13.

[2]段韵涵，韩北忠，杨葆华等，培养条件对金黄色葡萄球菌生物被膜生长的影响[J]，中国酿造，2003（3）：17-20.

[3]ChristofvonEiff，GeorgP，ChristineH. Pathogenesisofinfections duetocoagulasenegativeStaphylococci.LancetInfectDis，2002，2：677-685.

[4]FrebourgNB，LefebvreS，BaertS，etal.PCR-basedassayfordiscriminationbetweeninvasiveandcontaminatingStaphylococcusepidermidisstrains.JClinMicrobiol，2000，38（2）：877-880.

[5]HeilmannC，GerkeC，Perdreau-RemingtonF，etal.CharacterizationofTn917insertionmutantsofStaphylococcusepidermidisaffectedinbiofilmformation.InfectImmun，1996，64（1）：277-282.

[6]ChristianeG，AngelikaK，RoderichS.CharacterizationoftheNAcetylglucosaminyltransferaseactivityinvolvedinthebiosynthesisoftheStaphylococcusepidermidisPolysaccharideintercellularadhesin.JBiolChem，1998，279（29）：18586-18593.

[7]Christofv，GeorgP，ChristineH.PathogenesisofinfectionsduetocoagulasenegativeStaphylococci.LancetInfectDis，2002，2：677-685.

[8]丁露，黄小林，陈开森，等.金黄色葡萄球菌生物膜形成与ica操纵子关系探讨[J].实验与检验医学，2011，29（4）：353-354.

[9]马海乐，樊金玲.光甘草定检测提取纯化及其抑制酪氨酸酶活性的研究，河南科技大學，河南，2011，5：1-2.