固相萃取法与QuEChERS法对比检测无核荔枝中19种农药残留

李萍萍 张月 吴小芳 阳辛凤 张振山

摘 要 建立了气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）法同时测定无核荔枝中19种农药残留的分析方法。实验考察了固相萃取法和QuEChERS法中影响净化和萃取效果的各个因素，同时对二者的基质效应进行分析。结果表明：19种农药的线性范围在0.01～0.5 μg/mL，相关系数均大于0.99。在0.01、0.1、0.5 mg/kg加标水平下，采用固相萃取净化时，19种农药的平均回收率为67.0%～95.6%，RSD为2.5%～12%。采用QuEChERS净化时，19种农药的平均回收率在68.2%～125%，RSD为2.8%～12.7%。2种方法在灵敏度和精密度方面无显著差异，均符合农药残留分析要求。但固相萃取较QuEChERS基质效应小，净化相对彻底。QuEChERS较固相萃取具有简单、快速、环保等优点。2种方法均能对荔枝样品进行检测，且数据准确可靠。

关键词 气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）；固相萃取（SPE）；QuEChERS；农药；残留；无核荔枝

中图分类号 S667.1 文献标识码 A

Determination of 19 Pesticides Residues in Seedless-Litchi by

Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LI Pingping， ZHANG Yue， WU Xiaofang， YANG Xinfeng*， ZHANG Zhenshan

Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Tropical Agro-Products， Ministry of Agriculture / Analysis

and Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract Two methods of sample preparation were developed for simultaneous analysis of 19 pesticides residues in seedless-litchi in the study. Factors affecting purification and extraction efficiency in solid phase extraction（SPE）and QuEChERS methods were investigated and optimized. Matrix effects of two methods were analyzed. The results showed that the correlation coefficients were above 0.99 when the concentration was ranged from 0.01 to 0.5 μg/mL. For SPE cleanup method， when the fortified levels from 0.01 to 0.5 mg/kg， the average recoveries were ranged from 67.0% to 95.6% and the relative standard deviations（RSD）were ranged from 2.5% to 12%. For QuEChERS cleanup method， the fortified recoveries was at 0.01， 0.1 and 0.5 mg/kg were in the range of 68.2%-125%， with relative standard deviations（RSD）not more than 12.7%. All the above observations indicated that the two methods were no significant difference in sensitivity and accuracy and suitable for the determination of 19 pesticides in seedless-litchi. Besides， SPE method has the characteristics of relatively thorough purification and week matrix effect. QuEChERS cleanup is more simple， quick and green than SPE. The two methods were accurate and reliable for simultaneous determination of multiple pesticide residues in seedless-litchi.

Key words Gas chromatography-tandem mass spectrometry（GC-MS/MS）； solid phase extraction（SPE）； QuEChERS； pesticides； residue； seedless-litchi

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.030

荔枝（Litchi chinensis），屬于无患子科植物，是热带、南亚热带气候区的特种水果，被誉为“果中之王”。中国是世界上最大的荔枝生产国，栽培历史悠久[1-3]。通过实生选种和芽变选种已选育出了没有果核、个大汁多味甜的无核荔枝，受到消费者的追捧[4]。目前农药被广泛应用于杀灭作物病虫害，但农药大量使用甚至滥用也会导致荔枝果品严重污染，农药残留超标。为控制农药使用量，世界各国和国际组织均制定了农药中的最大残留限量值（MRLs）[5]。如CAC规定了200多种农药的MRLs；中国GB 2763-2016《食品中农药最大残留限量》也规定了417种农药的MRLs。因此开发灵敏度高、重现性好、可用于荔枝中多种农药残留的检测方法，不仅能够应对日益增多的农药检测项目，提高工作效率，更重要的是加强荔枝中农药污染的监测和监管，对保障农产品质量安全具有十分重要的意义。

目前农药残留的检测方法有气相色谱法[6-8]、液相色谱法[9-11]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[12-13]、液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[14]、气相色谱飞行时间质谱法、液相色谱飞行时间质谱法等。气相色谱法、液相色谱法对农药检测的种类有限，且易受到复杂基质干扰，假阳性问题难以解决。气相色谱/液相色谱飞行时间质谱价格昂贵，难以在普通实验室普及。气相色谱-串联质谱具有灵敏度高、选择性好、高通量、抗干扰能力强等优点，成为近年来农药多残留检测技术的主流方向。本研究选择19种在荔枝生产中应用最为广泛的杀虫、杀菌剂等农药进行研究，通过比较不同前处理方法的净化效果，建立了准确、可靠且能同时测定荔枝中19种农药的多残留检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

7890A-7000A气相色谱三重四级杆串联质谱仪（美国Agilent 公司）；高速均质器（德国IKA公司）； Sartorius万分之一电子天平（德国赛多利斯电子天平公司）；XK96A涡旋混合器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；LXJ-IIB高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Laborota 4 000真空旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；Carb/NH2石墨化碳/氨基复合柱、PSA、C18、GCB（美国Agilent公司）；无水硫酸镁、氯化钠、甲酸、甲苯（分析纯，广州化学试剂厂）。氯化钠在150 ℃下灼烧4 h，无水硫酸镁在650 ℃下灼烧4 h，冷却后置干燥器中备用。二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮、正己烷（色谱纯，美国Fisher公司）。

标准品：敌敌畏、水胺硫磷、对硫磷、倍硫磷、杀螟硫磷、五氯硝基苯、二嗪磷、腐霉利、甲氰菊酯、马拉硫磷、百菌清、氰戊菊酯、毒死蜱、乐果、虫螨腈、氟虫腈、氟虫腈砜、氟甲腈浓度均为1 000 μg/mL，购自天津农业部环境质量监督检验测试中心。二甲戊灵标准品纯度大于99%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 溶剂单标准储备液：准确称取二甲戊灵10 mg（精确至0.1 mg）置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到质量浓度为1 000 μg/mL的农药标准储备液。准确移取上述19种质量浓度为1 000 μg/mL农药标准品各1.00 mL分别于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，得到质量浓度为100 μg/mL的单标准储备液，储存于-18 ℃冰箱中。混合标准储备液：各移取0.5 mL上述100 μg/mL的单标准储备液于10 mL容量瓶中用正己烷定容至刻度，得到质量浓度为5.0 μg/mL的混合标准储备液，储存于-18 ℃冰箱中。混合基质标准工作溶液：为降低基质效应，需配制基质标准工作液。本实验采用两种不同的前处理方式（固相萃取法和QuEChERS法）制备两种不同的阴性样品提取液为溶剂分别得到浓度为0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL的混合基质标准工作溶液。

1.2.2 固相萃取柱净化法 提取：用电子天平称取25.0 g（精确至0.1 g）样品，置于150 mL烧杯中，加入50.0 mL乙腈，高速匀浆2 min后收集滤液20～30 mL倒入装有6.0 g氯化钠的具塞量筒中，盖好盖子剧烈震荡2 min，在室温下静置0.5 h后准确吸取10.00 mL上清液于鸡心瓶中，真空浓缩至干，用6.0 mL甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 3）分3次溶解，待净化。

净化：将Carb/NH2固相萃取柱用5.0 mL甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 3）预淋洗，将上述提取液上样并收集，用20 mL甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 3）洗脱Carb/NH2固相萃取柱，合并后濃缩至干。用2 mL正己烷溶解，供GC-MS/MS检测。

1.2.3 QuEChERS法 提取：称取10.0 g（精确至0.1 g）样品置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，3 g氯化钠，振摇2 min，4 500 r/min离心5 min。

净化：在10 mL离心管中加入150 mg PSA、15 mg GCB和900 mg 无水MgSO4，移取上述上清液8 mL，震荡混匀2 min后4 500 r/min离心5 min，取上清液4 mL于鸡心瓶中，真空旋转浓缩至干后2 mL正己烷定容，供GC-MS/MS检测。

1.2.4 GC-MS/MS条件 气相毛细管色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm i. d.×0.25 μm）；色谱柱升温程序为70 ℃保持2 min，后以25 ℃/min升温至150 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min 升温至280 ℃，保持6 min，共运行21.8 min；载气为氦气，纯度≥ 99.999%；流速1.0 mL/min，恒流模式；进样口温度250 ℃；进样量1 μL；不分流进样。离子源为电子轰击离子源（EI）； 离子源温度230 ℃；四级杆温度150 ℃；气相色谱-串联质谱接口温度280 ℃。溶剂延迟时间4 min；碰撞气氮气流速1.5 mL/min，猝灭气氦气流速2.25 mL/min。采用多反应监测（MRM）模式；溶剂延迟4 min。19种化合物检测的保留时间、离子对等相关参数见表1，100 ng/mL混合溶剂标准工作溶液的总离子流色谱图见图1。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

根据相似相容原理，本实验选择二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、1%乙酸乙腈为提取溶剂，对无核荔枝样品进行提取实验，并对提取效果进行比较。结果表明，采用丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯作为提取溶剂时，在提取目标农药的同时会提取出更多的脂肪、色素等杂质，增加后续净化的难度，另外，采用丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯作为提取溶剂时目标农药的回收率偏低。乙腈的极性较强，对绝大多数农药都有很好的提取效果，且提取的色素和脂肪类杂质少，降低基质干扰，减少仪器的维护频率和维护成本，采用乙腈和1%乙酸乙腈作为提取溶剂时，目标农药的回收率理想。比较乙腈和1%乙酸乙腈对目标农药回收率的影响发现二者回收率差别不大，为简化实验操作步骤及减少乙酸对色谱柱的伤害，因此本实验采用乙腈作为提取溶剂。

2.2 净化方法的选择

2.2.1 Carb/NH2固相萃取柱洗脱液的选择 采用乙腈、甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 1）、甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 3）、二氯甲烷-乙腈（体积比1 ∶ 1）、二氯甲烷-乙腈（体积比1 ∶ 3）作为洗脱液。结果表明：甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 3）作为洗脱液时19种农药的回收率最高，因此本实验选择甲苯-乙腈（体积比1 ∶ 3）作为洗脱溶剂。

2.2.2 Carb/NH2固相萃取柱洗脱体积的选择 考察不同体积（10、20、30、40 mL）的洗脱溶液对19种农药回收率的影响。结果显示，当洗脱体积为10、20、30、40 mL时，19种农药回收率分别为50%、90%、92%、89%。表明洗脱体积大于20 mL时，19种农药回收率差别不大，因此为降低检测成本及减少有机污染物对检测人员的伤害，本实验选择洗脱溶液的体积为20 mL。

2.2.3 QuEChERS法盐析剂的优化 本实验考察了3种盐析剂：NaCl（3 g）、乙酸盐缓冲盐（1 g NaCl，4 g无水MgSO4，1 g乙酸钠）、柠檬酸缓冲盐（1 g NaCl，4 g无水MgSO4，1 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氢二钠）对19种农药萃取效果的影响。结果表明：3种盐析剂对19种农药回收率无显著影响。为简化实验操作步骤，本实验选择3 g氯化钠为QuEChERS法的盐析剂。

2.2.4 QuEChERS法吸附剂及其用量的优化

QuEChERS法常用的吸附剂有PSA、GCB、C18。PSA主要用于除去基质中的极性物质如糖类、有机酸、脂肪酸及亲脂性色素等极性物质。GCB可以有效的去除色素等杂质。C18可以去除甾醇、脂肪等非极性杂质，本实验考察了添加（1）400 mg PSA、400 mg GCB；（2）150 mg PSA、15 mg GCB；（3）400 mg PSA；（4）150 mg PSA；（5）400 mg PSA、400 mg C18；（6）150 mg PSA、150 mg C18为净化剂时的净化效果。结果表明：采用（1）400 mg PSA、400 mg GCB为吸附剂时，除乐果、五氯硝基苯、百菌清、倍硫磷、毒死蜱、二甲戊灵的回收率低于50%外，其他农药的回收率均在70%～120%之间。这是由于GCB虽然可以有效去除色素等杂质，但同时其表面的六元环结构会吸附一些平面及对称结构的农药，导致五氯硝基苯、倍硫磷、百菌清等农药组分的回收率较低。采用方法（2）～（6）时19种农药的回收率在70%～130%之间，且以方法（2）为吸附剂时，基质效应最小。因此本实验选择方法（2）150 mg PSA、15 mg GCB作为净化剂，使其既能净化样品基质又保证目标农药的回收率。

2.2.5 QuEChERS法定容溶液的选择 QuEChERS法是一种简单、快速、便宜的样品前处理方法，传统的QuEChERS法如AOAC 2007.01[15]、EN 15662[16]等方法通常采用吸附剂净化离心后直接取乙腈层上机待测，但乙腈溶剂极性较强，对气相色谱柱（HP-5）损伤较大。此外，乙腈的膨胀系数较大，容易造成衬管过载，因此需要进行溶剂转化，本实验将样品吸附剂净化离心后取4 mL乙腈层真空旋转蒸发至干，用2 mL正己烷定容上机检测。

2.2.6 基质效应 基质效应是指从样品中与目标物同时提取出的共萃物对目标物分析产生的影响和干扰，在气相色谱中通常表现为基质增强效应。这是由于基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得更多的待测物流入色谱系统从而使检测信号增强。不同目标物、不同基质、不同前处理方法以及不同的仪器状态下，其基质效应差别较大[17-18]。当基质溶液中目标物农药的响应值与纯溶剂中农药响应值的比值大于1.2或小于0.8时必须采取补偿措施，通常采用基质匹配标准溶液校正法进行校正。本实验取基质空白样品，按照“1.2.2”和“1.2.3”进行前处理后，将5.0 μg/mL混合溶剂标准储备液用基质空白溶液稀释至0.5 μg/mL，同时用正己烷配制0.5 μg/mL纯溶剂标准溶液计算基质溶液中农药峰面积与纯溶剂中农药峰面积的比值。结果表明：在无核荔枝基质中，采用固相萃取前处理方式，10种农药存在基质增强效应，其他9种农药不存在基质效应。而采用QuEChERS前处理方式，19种农药均存在显著的基质增强效应。另外，与QuEChERS方法相比，固相萃取法的基质效应相对较小，其净化方式相对彻底。因此为对目标物进行准确定量，本实验采用基质标准溶液对目标物进行定量分析。

2.2.7 线性范围、准确度及精密度 分别按照乙腈提取-Carb/NH2固相萃取柱净化与乙腈提取-QuEChERS净化得到空白无核荔枝样品提取液，制备两种不同的基质标准工作液，19种农药的浓度在0.01～0.5 μg/mL范围内与目标物的响应值呈良好的线性关系，决定系数（r2）均大于0.99。按照上述最佳前处理条件，在空白无核荔枝样品中添加农药标准溶液，平行测定5次，当添加浓度的农药色谱峰面积达到3倍信噪比时为方法检出限；添加浓度的色谱峰面积达到10倍信噪比时为方法的定量限，结果见表2。

按照固相萃取净化与QuEChERS净化对阴性无核荔枝样品进行加标回收实验，选取高、中、低3个不同质量分数水平（0.01、0.1、0.5 mg/kg），平行测定5次，计算平均回收率和相对标准偏差（RSD）。结果见表2。从表2数据可知，采用固相萃取净化时，19种农药的平均回收率为67.0%～95.6%，RSD为2.5%～12%，采用QuEChERS净化時，19种农药的平均回收率在68.2%～125%，RSD为2.8%～12.7%。表明此2种方法无显著差异，均能对荔枝样品进行检测，且数据准确可靠，回收率与精密度均符合农药残留分析要求。

3 讨论

本研究分别采用传统的固相萃取法和最新的QuEChERS法测定无核荔枝样品中19种农药残留，研究结果与文献报道有部分差异，邓子尧[19]等采用传统的固相萃取法和GC-FPD、GC-ECD相结合测定荔枝中13种农药残留。本研究的固相萃取法无需将有机磷农药和菊酯类农药分别进行前处理，19种农药只需用同一种前处理方法处理好后进行GC-MS/MS检测，这样有利于简化操作步骤及节约时间，且GC-MS/MS的抗干扰能力更强，解决样品的假阳性问题。张群[20]等采用固相萃取法和GC-MS/MS相结合测定荔枝中3种农药残留。本研究不仅优化了固相萃取法，且将传统的固相萃取法和最新的QuEChERS法进行比较测定荔枝中常用的19种农药残留，检测的农残数量更多，对于荔枝中农药残留的监测更具有实际应用价值。

固相萃取法是传统的农药残留前处理方法，NY/T 761-2008行业标准亦采用固相萃取法对果蔬基质进行净化。QuEChERS法是一种简单、快速、便宜、溶剂用量少的高效提取和净化处理的方法，它是2003年由Anastassiades[21]等提出的样品前处理方法，该方法通过寻找合适的提取和净化试剂后，通过简单的离心将农药与样品基质分离后，进行上机检测。本实验建立了测定无核荔枝样品中19种农药残留的两种不同前处理检测方法。方法1采用传统的乙腈提取，固相萃取柱（Carb/NH2柱）净化、GC-MS/MS检测分析。方法2采用乙腈提取、QuEChERS净化、GC-MS/MS分析。2种方法的检出限、回收率等准确度和精密度均符合残留检测要求。但2种方法各有优缺点，方法1净化相对彻底，基质效应较小，仪器的维护成本和频率较低但其操作相对耗时且溶剂用量大。方法2净化粗糙，基质效应较大，但具有操作简单、溶剂用量小、检测成本低、对环境友好、检测快速等优点。2种方法适应性和可操作性强，均可用于无核荔枝中农药残留水平的检测。

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