云南自然发酵酸菜液中乳酸菌的分离鉴定及其发酵性能研究

奎梦漪 薛桥丽 康娇 胡永金

摘要[目的]对云南自然发酵酸菜液中的优势乳酸菌进行分离、鉴定及发酵性能研究。[方法]从云南自然发酵酸菜液中分离出12株乳酸菌，经优选筛选出4株性状优良的乳酸菌（S-3、S-6、S-8和S-10），通过形态学观察及生理生化试验对其进行鉴定，并研究其发酵性能。[结果]经鉴定，S-3和S-6为植物乳杆菌（Lactobacilllus plantarum），S-8为肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides），S-10为短乳杆菌（Lactobacillus brevis）。菌株S-6的发酵性能优良，产酸快，产酸量多，耐酸性较好，亚硝酸盐降解性能高，pH 3时仍能较好地生长。[结论]该研究结果可为了解云南传统酸菜发酵机制和控制酸菜发酵质量提供参考。

关键词酸菜；乳酸菌；分离；鉴定；发酵性能

中图分类号TS205.5文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）08-0107-03

Isolation，Identification and Fermentation Performance of Lactic Acid Bacteria from Natural Fermented Sauerkraut Broth in Yunnan

KUI Mengyi1，XUE Qiaoli2，KANG Jiao3，HU Yongjin3*（1.School of Life Sciences，Yunnan University，Kunming，Yunnan 650500； 2.Library of Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201； 3.College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201）

Abstract[Objective] The isolation and identification of the dominant lactic acid bacteria in natural fermented sauerkraut in Yunnan were investigated，and the fermentation performance of the isolated strains was measured.[Method] 12 strains from the natural fermented sauerkraut broth in Yunnan were isolated，and four strains of lactic acid bacteria （S-3，S-6，S-8 and S-10） with the fine fermentation were screening out.According to their colony morphology，staining property and biochemical reaction characteristics，S-3 and S-6 are Lactobacilllus plantarum，S-8 is Leuconostoc mesenteroides and S-10 is Lactobacillus brevis. The strain S-6 has very good performance，such as fast acidforming，large acidoutput and high nitrite degradation capacity.At the same time，acid fastness of the strain S-6 shows the best among the 4 strains，which could grow very well under the condition of pH 3.[Conclusion] The results provide a reference for the fermentation mechanism of traditional sauerkraut and control the quality of the natural fermented sauerkraut in Yunnan.

Key wordsSauerkraut；Lactic acid bacteria；Isolation；Identification；Fermentation performance

酸菜是我國传统的大众型蔬菜发酵食品，其营养物质丰富、质感脆嫩、味道酸爽、色泽鲜亮、开胃提神、醒酒去腻，不但能增进食欲、帮助消化，还可以促进人体对铁元素的吸收[1]，其汁液中也富含乳酸菌活菌，赋予酸菜多种营养保健功效[2-4]。酸菜也是云南蔬菜腌渍品中最主要的产品，但云南酸菜的生产依然是采用传统的自然发酵方法，发酵周期相对较长，发酵过程中容易污染，产品质量不稳定，生产效率低下，并且亚硝酸盐、食盐的含量高，对人体存在潜在危害[5]。笔者从云南传统发酵优良的酸菜中分离培养出优势乳酸菌，采用形态学、生理生化鉴定手段对筛选到的优势乳酸菌进行鉴定，并对其生理特性和发酵性能进行深入系统的研究，从中筛选出产酸快、同型乳酸发酵、具有特殊功能特性的优良乳酸菌菌株，旨在为促进云南酸菜这一传统食品的现代化生产，缩短酸菜生产周期，降低生产成本，提高酸菜的产品质量、产品生产的技术含量和经济效益奠定了理论基础，为制备更优良、安全性高的云南发酵蔬菜制品提供更丰富的菌种资源和科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料及主要试剂。酸菜：从云南通海普通家庭腌制酸菜中随机采集20份成熟酸菜样品；

培养基为MRS培养基。主要试剂：蛋白胨、酵母膏、吐温-80、牛肉膏、琼脂、乳酸。

1.1.2主要仪器设备。

精密pH计、AE100S电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；DHP-9272电热恒温培养箱、HWS24D恒温水浴锅，上海一恒科技有限公司；UV1800紫外可见分光光度计；ZHJH-C1115B超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；MLS-3750立式压力蒸汽灭菌锅，日本SANYO公司。

1.2乳酸菌的分离与鉴定

1.2.1乳酸菌的分离筛选。

初筛：将不同酸菜样品汁液分别用生理盐水进行梯度稀释，采用10倍梯度稀释法，选择适宜的稀释度，涂布在乳酸菌初筛平板上，37 ℃下培养48 h，挑取碳酸钙圈较大、培养基变黄的菌落。复筛：将初筛得到的菌株用接种针转接到复筛试管内斜面培养基上，37 ℃下培养36 h，将斜面培养基颜色变化较大的菌株转到平板培养基上纯化，分离出单菌落。纯化后的菌株于MRS斜面培养基中培养至对数生长期后置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2乳酸菌的鉴定。

①形态特征鉴定。菌落形态：观察MRS平板培养基上单菌落形态，菌株革兰氏染色。②产酸量测定。以酚酞作指示剂，采用氢氧化钠碱液滴定法进行测定[6]。③产乳酸鉴定。采用纸层析乳酸定性试验确定乳酸细菌[7]。④生理生化特性鉴定。参照《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》进行鉴定[8]。

1.3乳酸菌发酵性能分析

1.3.1乳酸菌生长特性测定。

供试菌株分别在无菌MRS培养液中活化2代，使菌株浓度达108 CFU/mL，以2%接种量接入灭菌的发酵培养基（蔬菜汁）中，在37 ℃下培养24 h，取发酵液2 mL 加入玻璃比色皿中，使用分光光度计在600 nm波长下测其吸光值，分析比较菌株的生长速率（μmax）和最大生长量（OD600）。

1.3.2产酸速率与产酸量测定。将

供试菌株分别在無菌MRS培养液中活化2代，使菌株浓度达108 CFU/mL，以2%接种量接入发酵培养基中（蔬菜汁），在37 ℃下培养24 h，分析比较菌株的最大产酸量（°T）。

1.3.3亚硝酸盐降解率的测定。

将经活化2次的供试菌株按菌株浓度108 CFU /mL、2%的接种量接入10 mL 已灭菌的含有10 mg/kg NaNO2（分析纯）的发酵培养基（蔬菜汁）中，在最适条件下培养24 h，采用盐酸萘乙二胺法（GB 5009.33—2016）测定NaNO2含量，同时以未接种乳酸菌的蔬菜汁作为空白对照，重复3次。

1.3.4耐酸性能测定。

将经活化2次的供试菌株按菌株浓度108 CFU /mL、2%的接种量分别接种至pH 2.0、2.5、3.0和3.5的MRS液体培养基中，37 ℃培养2 h，分别取0和2 h的菌液倾注平板进行活菌计数，计算酸作用2 h的存活率。

2结果与分析

2.1乳酸菌的分离筛选经分离优选得到12株菌株，结果见表1。

由表1可见，菌株透明圈大小与产酸量呈正相关。在S-1～S-12各菌株中，以S-6菌株的透明圈直径最大，达3.8 mm，产酸量最多，达2.98%；其次分别为S-3、S-10、S-8菌株，透明圈直径均超过3.0 mm，分别为3.6、3.5和3.1 mm，产酸量分别为2.68%、2.58%和2.24%；S-1菌株透明圈和产酸量均最低。根据菌株透明圈大小与产酸量，以S-3、S-6、S-8和S-10菌株作为优选出的4个高产酸菌株开展后续试验。

2.2乳酸菌的鉴定

2.2.1纸层析乳酸定性比较。

对乳酸标准溶液和S-3、S-6、S-8、S-10 4株菌株的发酵液进行比较，结果得发酵液的Rf值依次为0.736±0.002、0.729±0.004、

0.732±0.006、0.735±0.007、0.727±0.005。结果表明，S-3、S-6、S-8和S-

10菌株的发酵液中均含有乳酸，说明4个菌株均为产乳

酸菌株。

2.3菌株发酵性能研究

2.3.1生长速率与生长量。

对菌株生长量和生长性能进行测定以了解其生长周期及生长情况，S-3、S-6、S-8和S-10菌株的生长速率与生长量见表4。

可知，菌株S-3、S-6和S-10生长速率快，在蔬菜发酵前期其可以快速繁殖并成为发酵体系优势菌群，这可抑制发酵过程中的杂菌生长，从而减少其有害代谢产物的积累。

2.3.2产酸量。各菌株的产酸速度和产酸量大小见图1。从图1可以看出，各菌株产酸量不断增加，在生长过程中，乳酸菌快速繁殖产酸，使发酵液的pH 迅速下降。发酵过程中，酸度大小是

影响发酵蔬菜质量的重要因素之一，也是衡量乳酸菌性能优劣的重要参考依据。发酵48 h，S-6菌株具有最大的产酸量，其次分别为S-3和S-10菌株，产酸量最小的是S-8菌株。

2.3.3亚硝酸盐降解能力。

不同种类乳酸菌降解亚硝酸盐能力不同，即使同一种类的不同菌株之间降解亚硝酸盐的能力也会有所差异，筛选降解亚硝酸盐能力强的菌株，对于保证泡菜质量安全十分必要。S-3、S-6、S-8和S-10菌株降解亚硝酸盐的能力见图2。

可以看出，各供试菌株对亚硝酸盐均有一定的降解能力。亚硝酸盐降解率最高的为S-6菌株，降解率可以达85.8%；亚硝酸盐降解率最低的菌株为S-8，降解率只有64.2%。

2.3.4耐酸性能。S-3、S-6、S-8和S-10菌株在不同酸性环境下的存活率如图3所示。

由图3可知，供试菌株在pH 3.5均具有较高的存活率，S-6菌株 2 h后存活率42.32%。但随着pH的降低，各菌株存活率逐渐下降。在pH 2.0环境2 h后，存活率最高的仍是S-6菌株，为8.78%；存活率最低的菌株为S-8，为2.32%。

3结论

从云南自然发酵酸菜汁中分离得到12株产酸菌株。采用形态学观察结合生理生化特性分析对S-3、S-6、S-8和S-10这4个高产酸菌株进行鉴定，S-3和S-6菌株为植物乳杆菌，S-8为肠膜明串珠菌，S-10为短乳杆菌。最终得出，S-6菌株具有优良的发酵性能。

参考文献

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[8] 凌代文，东秀珍.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.

安徽农业科学，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（8）：110-114