茶树对铅胁迫的响应及其组织铅化学形态变化研究

叶江华 吴承祯 贾小丽 陈晓婷 李远华 王飞权 卢莉 郑茂钟 胡永乐 张清旭 王海斌

摘 要 為了分析不同茶树对Pb（铅）胁迫的响应及其组织中不同化学形态Pb的累积特性，本研究采用盆栽种植法，探讨铁观音、肉桂2种茶树在不同浓度Pb胁迫下，茶树叶片光合生理指标，包括光合作用速率和叶绿素含量，以及茶树组织Pb含量和不同化学形态Pb含量的变化。结果表明，随着Pb浓度的增加，茶树光合生理指标呈现下降趋势，且与对照相比，铁观音下降的幅度高于肉桂。同一Pb胁迫浓度下，茶树组织中Pb含量表现为根>叶。不同化学形态Pb含量分析结果表明，随着Pb胁迫浓度的升高，2种茶树根部可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb和残留态Pb含量百分比呈现下降趋势，而有机结合态Pb和铁锰氧化态Pb含量呈现上升趋势；2种茶树叶片碳酸盐结合态Pb、可交换态Pb、铁锰氧化态Pb和有机结合态Pb百分含量呈现上升趋势，而残留态Pb百分含量呈现下降趋势。进一步分析发现，在Pb胁迫下，不同的茶树表现出解毒模式的差异性。

关键词 茶树；Pb胁迫；化学形态；光合生理指标

中图分类号 S571.1 文献标识码 A

Biological Responses and Pb Speciation in Tissues After

Pb Exposure of Tea Plants

YE Jianghua1，4， WU Chengzhen1， JIA Xiaoli1，3， CHEN Xiaoting2，3， LI Yuanhua4， WANG Feiquan4，

LU Li4， ZHENG Maozhong1， HU Yongle1， ZHANG Qingxu2， WANG Haibin2，3 *

1 Fujian Provincial Key Laboratory of Eco-Industrial Green Technology（Wuyi University）， Wuyishan， Fujian 354300， China

2 College of Life Sciences， Longyan University， Longyan， Fujian 364012， China

3 Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring， Fujian Agriculture and Forestry

University， Fuzhou， Fujian 350002， China

4 College of tea and food science， Wuyi University， Wuyishan 354300， China

Abstract In order to analyze the physiological responses of different tea trees to Pb stress and accumulation characteristics of Pb with different chemical forms in different tissues of tea trees， photosynthesis rate， chlorophyll content， Pb content in different tissues and Pb content with different chemical forms of Tieguanyin and Rougui tea plants were measured under Pb stess with different concentrations in pot culture. Results showed that the photosynthesis rate and chlorophyll content of tea plants descended with the increase of Pb stress concentration， but the falling range of Tieguanyin was higher than Rougui as compared with the control. At the same concentration of Pb stress， Pb contents in tea plant roots and leaves performed root> leaf. Analysis of Pb contents with different chemical forms showed that the content percentages of exchangeable Pb， carbonate-bound Pb， residual Pb from two tea tree roots had downward trends， while organic-bound Pb and Pb with Fe-Mn oxidation state had upward trends as stress concentration increased. Content percentages of exchangeable Pb， carbonate-bound Pb， organic-bound Pb and Pb with Fe-Mn oxidation state in the leaf appeared to be rising， while residual Pb declined. Further analysis indicated that detoxification patterns of different tea plant varieties exhibited variance under Pb stress.

Key words Tea plant； Pb stress； chemical form； physiological characteristics

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.005

近年来，随着工业化进程的加快，农业生产中大量使用含重金属元素的农药及肥料，农业灌溉用水重金属污染等问题的日益严重，导致土壤重金属污染加剧[1]。茶树作为喜酸性植物，长期种植后土壤的酸化程度不断增强，重金属活跃能力提高，有效态重金属含量在土壤中呈现上升趋势，可能茶树对重金属的耐受力有所提升，同时，也极易导致茶树组织增加重金属积累量，进而导致茶叶产品中重金属含量超标，严重损害了茶叶的经济效益，降低了茶农收入[2-5]。

茶树易吸收累积铅离子，铅（Pb）主要通过根系或叶片进入植物体，经过大量累积，会导致植物体中活性氧代谢失调，严重者还会影响植物生长发育[6]。众多学者探讨了重金属对植物生长的影响，并认为高浓度重金属会对植物生长具有一定的毒害作用[7-9]。目前，关于Pb对茶树生长的影响体现在以下2方面，一方面土壤Pb含量对茶树生长的影响，研究表明茶园土壤中各形态Pb的含量为硫化物残渣态>碳酸盐结合态>吸附态>有机结合态>交换态>水溶态，其中土壤中有效性Pb含量的高低决定了Pb对茶树的毒害能力[10]；另一方面，Pb离子进入到茶树体内后，在茶树体内分布的形态、特征、活性、迁移能力等是影响茶树生长的关键[11-12]。

近年来，茶叶经济价值的提升，含重金属的农药、化肥、有机肥等被大量施用，从而保证茶叶的产量，一方面致使茶园土壤中Pb含量增加，另一方面增加茶树Pb元素积累量[4-5]。而前人研究主要集中在茶叶加工成品中重金属的溶出率、重金属在茶树中的累积特性及重金属对茶树生长的影响等[13-15]，关于重金属胁迫后，其离子在茶树体内的积累及化学形态变化未做较深入研究。鉴于此，本研究以铁观音、肉桂2种具有代表性的乌龙茶树为研究对象，探讨Pb胁迫下，茶树光合生理特征变化及其组织中Pb累積特性和化学形态变化，以期为研究Pb对茶树的毒害机理和茶树对Pb的响应机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 Pb胁迫处理30 d后，收集茶树根（离根尖2 cm）和倒二叶，用于测定茶树根、叶中Pb含量和不同化学形态Pb含量。茶树叶片收集后，用自来水和去离子水洗涤3次，茶树根收集后仔细清除表面附着的土壤，用去离子水洗涤10次，避免根部表面附着金属离子。

1.1.2 茶树种植与不同处理 将未种植过茶树的土壤风干并研磨，过40目筛；土壤的基本理化指标为pH5.21、有机质18.43 g/kg、全氮2.05 g/kg、全磷0.43 g/kg、全钾4.35 g/kg、速效氮124.52 mg/kg、速效磷13.17 mg/kg、速效钾126.31 mg/kg、Pb 2.13 mg/kg。将土壤装入盆中，每盆装土10 kg，选择长势相对一致的1年生铁观音、肉桂茶苗，分别移栽到土壤中，每盆种植茶苗5株；茶苗移栽恢复生长1个月后，将茶苗种植土壤适当搅动使土壤松动，将配置好的醋酸铅溶液缓慢倒入土壤中，尽量使处理液在土壤中分布均匀，每盆添加量2 L，使土壤中的Pb浓度分别达到50、150、250、350、450 mg/kg，未添加Pb溶液处理的土壤为对照（定义为0 mg/kg）；处理后，常规种植茶树30 d，每个处理种植6盆，即6个重复。

1.2 方法

1.2.1 茶苗光合生理指标测定 Pb胁迫处理30 d后，选取不同处理下的茶苗倒二叶（功能叶），采用LI-6400便携式光合仪测定茶苗功能叶光合作用速率；采用SPAD-502叶绿素仪测定茶苗倒二叶的SPAD值，即叶绿素含量，每个样品重复测定6次。

1.2.2 茶苗组织Pb含量测定 参照赵先明等[16]研究的方法，并略作修改。将不同浓度Pb处理下，茶苗的根、叶于80 ℃干燥至恒重，并分别粉碎过40目筛，待测。分别称取上述样品0.5 g置于150 mL聚四氟乙烯烧杯中，加入25 mL浓硝酸和高氯酸混合液（体积比为5 ∶ 1），盖上表面皿，浸泡过夜。次日，160 ℃加热消解，至消化液呈淡黄色或无色，体积约为1～2 mL为止。冷却后，用少量蒸馏水多次洗涤烧杯，合并洗涤液并转入50 mL的容量瓶中，定容，混匀过滤，待测，且每个样品3个重复。同时，以试剂空白为对照。通过原子吸收分光光度法进行数据测定。

1.2.3 茶苗组织中不同化学形态Pb含量测定

不同浓度Pb处理下，采用化学试剂逐步提取法提取茶苗组织中不同化学形态的Pb[17-18]，所需提取剂及提取顺序依次为：80%乙醇，提取可交换态Pb；去离子水，提取碳酸盐结合态Pb；1 mol/L的氯化钠溶液，提取有机结合态Pb；2%醋酸，提取铁锰氧化态Pb；0.6 mol/L的盐酸，提取残留态Pb。具体提取方法为：称取2 g茶苗组织新鲜样品置于烧杯中，加入25 mL提取剂，浸没样品，置于30 ℃恒温箱中静置18 h，回收提取液。继续添加等体积的同一提取剂浸提2 h，再次回收提取液，重复3次，即24 h内完成4次提取。回收的提取液转移至烧杯。依照上述方法对各样品进行不同提取剂的提取，同时每个样品设置3个重复。

将不同提取剂获得的提取液蒸发至近干，去离子水定容至10 mL，以相应提取剂为空白对照，原子吸收分光光度法测定样品中Pb含量。

1.3 数据统计分析

数据使用Excel、DPS软件进行方差分析、显著性分析以及相关性分析。

2 结果与分析

2.1 光合作用速率、叶绿素含量分析

Pb胁迫下，随着Pb浓度的增加，茶树叶片光合生理相关指标呈现下降趋势（图1）。与对照相比，随着Pb浓度的升高（50～450 mg/kg），铁观音茶树叶片的光合作用速率、叶绿素含量下降率分别由3.77%上升至32.08%、5.64%上升至47.78%，肉桂茶树叶片的光合作用速率、叶绿素含量下降率分别由1.79%上升至19.64%、2.72%上升至39.10%；可见，2种茶树叶片的光合作用速率、叶绿素含量响应Pb胁迫的敏感性存在一定差异。

2.2 Pb含量分析

不同Pb浓度胁迫下，随着土壤Pb浓度的增加，茶树根、叶的Pb含量均呈现上升趋势，且根部Pb含量明显高于叶部（图2）。进一步分析发现，随着Pb浓度的升高（0～450 mg/kg），铁观音茶树根部Pb含量由0.53 mg/kg上升至85.87 mg/kg，肉桂则由0.56 mg/kg上升至88.12 mg/kg；叶部Pb含量，铁观音由0.27 mg/kg上升至48.14 mg/kg，肉桂由0.29 mg/kg上升至51.38 mg/kg。可见，不同浓度Pb胁迫下，不同茶树根、叶中Pb含量差异较小。

2.3 不同化学形态Pb含量分析

由图3和图4可知，随着Pb浓度的增加（0～450 mg/L），2种茶树根部可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb和残留态Pb百分含量呈现下降趋势，铁观音分别为9.82%～18.41%、10.21%～23.24%、12.13%～31.45%，肉桂分别为9.35%～16.17%、10.79%～25.21%、11.06%～34.26%；而有机结合态Pb和铁锰氧化态Pb百分含量在2种茶树中均表现为上升趋势，即铁观音分别为19.52%～42.53%和7.38%～25.31%，肉桂分别为16.32%～30.53%和8.04%～38.27%。可见，Pb胁迫下，随着土壤Pb胁迫浓度的增加，茶树根部有机结合态Pb和铁锰氧化态Pb百分含量不断上升，而可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb和残留态Pb则相反；铁观音与肉桂2种茶树在可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb和残留态Pb百分含量差异较小，而有机结合态Pb百分含量上，铁观音明显高于肉桂；铁锰氧化态Pb百分含量则肉桂明显高于铁观音。

由图3和图4可知，随着Pb浓度的增加，铁观音和肉桂叶部可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb、有机结合态Pb和铁锰氧化态Pb百分含量呈现上升趋势，铁观音分别为9.31%～21.23%、5.13%～9.58%、6.87%～15.27%和10.31%～22.65%，肉桂分别为8.83%～15.14%、5.48%～10.23%、7.96%～10.12%和12.46%～19.27%；而残留态Pb百分含量呈现下降趋势，铁观音为31.27%～68.38%，肉桂则为45.24%～65.27%。分析表明，Pb胁迫下，铁观音叶片的可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb、有机结合态Pb百分含量明显高于肉桂，铁锰氧化态Pb百分含量则低于肉桂。

2.4 生理指标及其组织Pb含量的相关性分析

Pb胁迫下，茶树根部指标相关性分析表明（表1），土壤Pb浓度与铁观音茶树根部Pb、根部可交换态Pb、有机结合态Pb、铁锰氧化态Pb含量呈显著或极显著正相关；而土壤Pb浓度与肉桂茶树根部Pb含量、根部有机结合态Pb含量、铁锰氧化态Pb含量呈显著或极显著正相关；此外，2种茶树的根部Pb含量均与茶树根部可交换态Pb、有机结合态Pb、碳酸盐结合态Pb、铁锰氧化态Pb、残留态Pb含量呈显著或极显著正相关。可见，随着土壤中Pb浓度的增加，茶树根部Pb含量呈显著上升趋势，而根部组织中Pb含量变化会显著性影响根部组织中不同化学形态Pb含量的变化。

茶树叶片指标的相关性分析结果表明（表2），Pb胁迫下，土壤Pb浓度與两种茶树叶片Pb、叶片可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb、有机结合态Pb、铁锰氧化态Pb、残留态Pb含量呈显著或极显著正相关，而与叶片光合作用速率、叶绿素含量呈极显著负相关；两种茶树叶片Pb含量与叶片可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb、有机结合态Pb、铁锰氧化态Pb、残留态Pb含量呈显著或极显著正相关，而与叶片光合作用速率、叶绿素含量呈显著或极显著负相关。可见，随着Pb浓度的增加，茶树叶片Pb含量及其不同化学形态Pb含量均显著上升，而叶片生理指标-光合作用速率、叶绿素含量则显著下降。

3 讨论

Pb是植物的非必需元素，过量的Pb进入植株体内，会引起植物的一系列生理响应，如植物吸收过量的Pb离子，易导致植物光合系统受损，最终影响植物产量和品质[19-20]。本研究中，铁观音和肉桂茶树叶片光合作用速率、叶绿素含量对Pb胁迫水平的敏感性有所不同，随着Pb胁迫水平的升高，2种茶树叶片的光合作用速率、叶绿素含量均不断下降（图1，表2），与前人有关研究[21-23]结果一致；与对照相比，同一浓度Pb作用下，铁观音叶片光合生理相关指标含量下降率明显高于肉桂（图1）。可见，Pb胁迫可能导致茶树生理特性变化，而铁观音表现出对Pb胁迫的敏感性优于肉桂，肉桂具有更强的重金属耐受性和适应性。

Pb离子通过根系吸收，在植物体内转运，并在不同的部位积累[24]。据报道，茶树体内Pb含量可以明显高于周围环境，且体内器官组织中Pb的分布率差异明显[25]。本研究表明，随着Pb浓度的升高，茶树不同组织中Pb含量均呈现上升趋势，且Pb含量趋势为根>叶，铁观音和肉桂同一组织的Pb累积量无明显差异（图2）。可见，不同的茶树在Pb吸收和累积等方面存在着一定的相似性。

植物对金属离子的耐受性体现为：一方面由于自身对金属离子浓度的拮抗作用，减少摄入；另一方面是不同植物对吸收后的金属离子的转化及解毒机制存在差异[26-27]。比如，金属离子进入植物体后，被转化为不同化学形态，即植物响应金属离子胁迫的策略表现为不同化学形态金属离子的含量及其所占比例的不同[28]。据报道，茶树具有吸收并累积铅的生理特征，那么茶树可能存在铅的特殊解毒机制[29]。本研究发现，Pb胁迫下，随着Pb胁迫浓度的增加，茶树根部有机结合态Pb和铁锰氧化态Pb含量百分比不断上升，而可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb和残留态Pb则相反；2种茶树叶部可交换态Pb、有机结合态Pb、碳酸盐结合态Pb和铁锰氧化态Pb百分含量呈现上升的趋势，残留态Pb含量则相反（图3、图4）。前人研究表明，可交换态的金属是毒害植物、影响其物质代谢的关键形态，碳酸盐态金属离子结合较弱，容易释放，容易迁移，以上2种形态金属的比率可作为金属离子植物造成危害的能力的评价因子[18]。而有机结合态主要是与蛋白质结合，极易影响植物代谢过程中的酶活性及其功能的表达，从而影响植物的生长[30]。铁锰氧化态和残留态可将金属离子固定形成难溶的化合物，也是植物抵御毒害特有的机制[31-32]。本研究中，Pb胁迫下，与肉桂相比，铁观音叶片光合生理指标下降幅度更大，对Pb胁迫更敏感，可能是由于二者解毒模式的差异，即叶片中不同化学形态Pb含量存在差异，铁观音叶片的可交换态Pb、碳酸盐结合态Pb、有机结合态Pb百分含量明显高于肉桂，铁锰氧化态Pb百分含量则低于肉桂。

综上所述，本研究以铁观音、肉桂为材料，探讨不同茶树品种对Pb胁迫的响应及其组织中不同化学形态Pb的累积特性，结果表明，Pb胁迫可降低2种茶树的光合作用速率及叶片叶绿素含量，其中铁观音的下降幅度高于肉桂；其次，不同茶树组织中Pb含量表现为根>叶，且不同的茶树品种对Pb胁迫表现出的解毒模式存在差异，铁观音茶树根、叶部主要以提高有机结合态Pb降低毒害，而肉桂以提高铁锰氧化态Pb降低毒害。关于不同化学形态Pb在植物组织中形成后，如何影响细胞变化，最终影响植物生长发育，还有待进一步研究。

参考文献

[1] 段德超， 于明革， 徐 辰， 等. 外源胡敏酸对土壤有机质组分变化的影响及其与茶树铅有效性的关系[J]. 土壤学报， 2013， 50（5）： 940-947.

[2] Zhang Z C， He X L， Li T X. Status and evalution of the soil nutrients in tea plantation[J]. Procedia Environmental Sciences， 2012， 12： 45-51.

[3] Li W， Zheng Z C， Li T X， et al. Effect of tea plantation age on the distribution of soil organic carbon fraction within water-stable aggregates in the hilly region of western Sichuang， China[J]. Catena， 2015， 133： 198-205.

[4] Alcolea A， Vázquez M， Caparrós A， et al. Heavy metal removal of intermittent acid mine drainage with an open limestone channel[J]. Minerals Engineering， 2012， 26： 86-98.

[5] Davies H， Weber P， Lindsay P， et al. Characterisation of acid mine drainage in a high rainfall mountain environment， New Zealand[J]. Science of the Total Environment， 2011， 409： 2 971-2 980.

[6] 申 璐， 肖 斌， 周 旋， 等. 外源亞精胺对铅胁迫下茶树生长的影响[J]. 茶叶科学， 2014， 34（1）： 87-94.

[7] Navarro M， Wood R J. Plasma changes in micronutrients following a multivitamin and mineral supplement in healthy adults[J]. Journal of the American College of Nutrition， 2003， 22： 124-129.

[8] Sarma L S， Kumar J R， Reddy K J， et al. Development of an extractive spectro-photometric method for the determination of copper（II） in leaf vegetable and pharmaceutical samples using pyridoxal-4-phenyl-3-thiosemicarbazone （PPT）[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2005， 53： 5 492-5 498.

[9] Wan Ngah W S， Hanafiah M A K M. Removal of heavy metal ion from wastewater by chemically modified plant wastes as adsorbrnts： a review[J]. Bioresource Technology， 2008， 99： 3 935-3 948.

[10] 周国华， 孙彬彬， 贺 灵， 等. 安溪土壤-茶叶铅含量关系与土壤铅临界值研究[J]. 物探与化探， 2016， 40（1）： 148-153.

[11] Wang X， Liu Y G， Zeng G M， et al. Sub cellular distribution and chemical forms of cadmium in Bechmeria nivea （L.） Gaud[J]. Environmental and Experimental Botany， 2008， 62： 389-395.

[12] Wu F B， Dong J， Qian Q Q， et al. Sub cellular distribution and chemical forms of Cd and Cd-Zn interaction in different barley genotypes[J]. Chemosphere， 2005， 60： 1 437-1 446.

[13] Wang L， Jiang L， Zhao Z Y， et al. Lithium content of some teas and their infusions consumed in China[J]. Food Science and Biotechnolog， 2014， 23（1）： 323-325.

[14] Mehra A， Barker C L. Leaching and bioavailability of aluminium， copper and manganese from tea （Camellia sinensis）[J]. Food Chemistry， 2007， 100： 1 456-1 463.

[15] Seenivasan S， Manikandan N， Muraleedharan N N， et al. Heavy metal content of black teas from South India[J]. Food Control， 2008， 19： 746-749.

[16] 赵先明， 汪艳霞， 杜 晓， 等. 水培茶树对铅的吸收與累积特性研究[J]. 茶叶科学， 2011， 31（3）： 237-246.

[17] Wu F B， Dong J， Qian Q Q， et al. Subcellular distribution and chemical form of Cd and Cd-Zn interaction in different barley genotypes[J]. Chemosphere， 2005， 60（10）： 1 437-1 446.

[18] 赵晓东， 谢英荷， 李廷亮， 等. 植物对污灌区土壤锌形态的影响[J]. 应用与环境生物学学报， 2015， 21（3）： 477-482.

[19] Qiao X Q， Shi G X， Jia R， et al. Physiological and biochemical responses induced by lead stress in Spirodela polyrhiza[J]. Plant Growth Regulation， 2012， 67（3）： 217-225.

[20] Zeng L S， Liao M， Chen C L， et al. Effects of lead contamination on soil enzymatic activities， microbial biomass， and rice physiological indices in soil-lead-rice （Oryza sativa L.） system[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2007， 67（1）： 67-74.

[21] 王琼瑶. 镉、 铜、 铅胁迫下蒲儿根生理特性和富集特征研究[D]. 雅安： 四川农业大学， 2011.

[22] 衣艳君， 李芳柏， 刘家尧. 尖叶走灯藓 （Plagiomnium cuspidatum）叶绿素荧光对复合重金属胁迫的响应[J]. 生态学报， 2008， 28（11）： 5 437-5 444.

[23] 孙天国， 沙 伟， 刘 岩. 复合重金属胁迫对两种藓类植物生理特性的影响[J]. 生态学报， 2010， 30（9）： 2 332-2 339.

[24] Mohammad N， Samar M， Alireza I. Levels of Cu， Zn， Pb， and Cd in the leaves of the tea plant （Camellia sinensis） and in the soil of Gilan and Mazandaran farms of Iran[J]. Food Measure， 2014， 8： 277-282.

[25] Han W Y， Zhao F J， Shi Y Z， et al. Scale and causes of lead contamination in Chinese tea[J]. Environmental Pollution， 2006， 139： 125-132.

[26] Suthee J， Sheila M P， Pimluck K， et al. Copper， lead and zinc removal from metal-contaminated wastewater by adsorption onto agricultural wastes[J]. Environmental Technology， 2015， 36（24）： 3 071-3 083.

[27] Mahendran V， Shanmugam S. One-pot synthesis of hydrazono-sulfonamide adducts using Cu（BTU） MOF catalyst and their remarkable AIEE properties： unprecedented copper（II）-catalyzed generation of ketenimine[J]. RSC Advances， 2015， 5： 20 003-20 010.

[28] 江行玉， 赵可夫. 植物重金属伤害及其抗性机理[J]. 应用与环境生物学学报， 2001， 7（1）： 92-99.

[29] 郭 巍. 铜、铅在土壤-植物系统中环境化学行为的研究[J]. 江苏环境科技， 2006， 19（2）： 10-12.

[30] 彭 勃， 黄小平， 张大文. 泰来藻、 海昌蒲体内铜的化学形态与累积规律[J]. 生态学杂志， 2010， 29（10）： 1 993-1 997.

[31] 谢立祥， 常明庆， 王 平， 等. 微波萃取土壤中重金属Cr的形态分析研究[J]. 环境科学与技术， 2010， 33（12）： 90-93.

[32] 陈牧霞， 地里拜尔·苏力坦， 杨 萧， 等. 新疆污灌区重金属含量及形态研究[J]. 干旱区资源与环境， 2007， 21（1）： 150-154.