EMS诱变苦荞突变体与其亲本的比较分析

2017-05-30张以忠邓琳琼

热带作物学报 2017年9期

张以忠邓琳琼

摘要利用凱氏定氮法、三氯化铝法、蒽酮比色法、愈创木酚法、KMnO4滴定法、氮蓝四唑NBT光还原法和分光光度法对荞麦矮杆突变体（M1）、小粒突变体（M2）、早熟突变体（M3）、晚熟突变体（M4）、大叶突变体（M5）和对照（CK）籽粒的蛋白质、黄酮、可溶性糖、总叶绿素含量以及叶片的过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物岐化酶（SOD）活性进行研究。结果表明：M1黄酮含量和CAT活性显著高于CK，POD活性显著低于CK，而蛋白质、可溶性糖、总叶绿素含量以及SOD活性与对照间的差异均不显著。M2黄酮、可溶性糖、总叶绿素含量和CAT活性显著高于CK，蛋白质含量和POD活性与CK间差异不显著，而SOD活性显著低于CK。M3的CAT和SOD活性均显著低于CK，而蛋白质、黄酮、可溶性糖、总叶绿素含量以及POD活性与CK均无显著差异。M4蛋白质含量显著高于CK，CAT活性与CK无显著差异，M5的CAT 活性显著高于CK，蛋白质含量与CK差异不显著，而两者的黄酮、可溶性糖、总叶绿素含量以及POD和SOD活性均显著高于CK。

关键词荞麦突变体；蛋白质；黄酮；可溶性糖；POD；SOD；CAT；叶绿素

中图分类号 S517 文献标识码 A

Comparative Analysis of Fagopyrum tataricum Mutants

and Its Parents in EMS Mutagenesis

ZHANG Yizhong1， 2 *， DENG Linqiong2

1 School of Life Science， Southwestern University， Chongqing 400715， China

2 Ecological Engineering School， Guizhou University of Engineering Science， Bijie， Guizhou 551700， China

Abstract The protein， flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll contents and the activity of peroxidase（POD）， catalase（CAT）， superoxide dismutase（SOD）of the mutants of Fagopyrum tataricum including Dwarf mutants（M1）， small-grain mutants（M2）， early-maturity mutant（M3）， late-maturity mutants（M4）， big-leaf mutants（M5）of were studied by means of Kjeldahl， AlCl3， anthrone colorimetry， spectrophotometry， guaiacol， KMnO4 titration， nitro blue tetrazolium（NBT）and photo-reduction methods. The results showed that the flavonoid contents and the CAT activity of M1 were significantly higher than that of CK， POD activity significantly was lower than that of CK. However， the differences of protein， soluble sugar， total chlorophyll and SOD activity were not significant with that of CK. The flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll contents and the CAT activity of M2 were significantly higher than that of CK， and the protein contents and the POD activity of M2 were not significantly with that of CK. While the activity of M2 was significantly lower thanthat of CK. The CAT and SOD activity of M3 were significantly lower than that of CK， while the protein， flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll contents and the POD activity were no significant difference from that of CK. The protein contents of M4 were significantly higher than that of CK， and the CAT activity was no significant different. The protein contents of M5 were no significant difference from that of CK. But its CAT activity were significantly higher than that of CK. Whereas the contents of flavonoid， soluble sugar， total chlorophyll， POD and SOD were higher than that of CK.

Key words Buckwheat mutants； protein； flavonoid； soluble sugar； POD； CAT； SOD； chlorophyll

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.004

突变体是某个性状发生可遗传变异或某个基因发生突变的材料，是作物遗传育种的重要资源，也是开展功能基因研究的重要材料，尤其是具有少数优良性状的突变体，更是研究功能基因难得的材料[1-3]。突变品种的成功应用，在世界范围内促进了农业增产，创造了显著的经济效益[4-5]。

苦荞（Fagopyrum tataricum）是蓼科（Polygonaceae）荞麦属（Fagopyrum Mill）的2个栽培种之一[6]。富含黄酮、蛋白质、淀粉、粗纤维、维生素、矿物元素等，能有效地控制糖尿病、预防心血管硬化、高血压，增加身体对疾病的免疫力等[7-9]。虽然苦荞具有较高的营养价值和药用价值，其产品越来越受到人们的喜爱和重视，但荞麦的低产性严重阻碍了荞麦产业化的发展，高品质荞麦品种的获得仍然存在一定的挑战。近年来，由于诱发突变技术广泛应用于植物品种改良，在水稻、小麦、玉米、油菜等多种作物上获得了一批常规种质资源库中少见的突变材料，大大提高了传统作物杂交育种的进程，也为功能作物育种和产品开发提供了重要技术手段和种质资源[10-13]。荞麦相关研究虽然滞后于水稻、小麦、玉米等大作物，但由于其自身具有这些大作物中没有但对人体健康非常重要的特殊成分，越來越受到人们的重视。目前已利用物理诱变方法在荞麦上获得了一些突变体，并对其做了一些农艺性状和品质性状的研究工作[14-18]。而在荞麦化学诱变方面，笔者首次利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（Ethyl methane sulphonate，EMS）创建了苦荞突变体，通过筛选，获得了稳定的矮杆突变体（M1）、小粒突变体（M2）、早熟突变体（M3）、晚熟突变体（M4）、大叶突变体（M5）。由于突变体蛋白质含量、总黄酮含量、可溶性糖含量、总叶绿素含量、POD活性、CAT活性、SOD活性的变化是评价突变体材料优劣的重要指标。鉴于此，对这些突变体与原亲本进行比较分析，摸清它们的品质特征及其抗逆性，为其进一步利用提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用的苦荞亲本材料（CK）为贵州毕节长期栽培的苦荞品种，矮杆突变体（M1）、小粒突变体（M2）、早熟突变体（M3）、晚熟突变体（M4）、大叶突变体（M5）是利用EMS诱变亲本（CK），筛选所获得的稳定株系。

1.2 方法

蛋白质和叶绿素含量测定参照文献[19]、总黄酮含量测定参照文献[20]、可溶性糖含量测定参照文献[21]、POD和CAT活性测定参照文献[19，22]、SOD活性参照文献[22-23]的方法。

1.3 数据处理

利用Excel 2007进行数据处理及作图，利用SPSS21.0统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白质含量

由不同荞麦蛋白质含量图可知（图1），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）蛋白质含量差异较小，变化范围为12.57%～14.58%。M4含量最高，为14.58%，是对照（CK）的1.16倍，且差异达到极显著水平。M1和M3含量较高，差异较小，分别为13.35%和13.42%。M2和M5含量较低，分别为12.57%和12.86%。M1、M2、M3、M5均高于CK，但差异未达到显著水平。

2.2 黄酮含量

由不同荞麦黄酮含量图可知（图2），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）黄酮含量在6.47%～9.33%之间。含量最高的是M4，为9.33%，是对照（CK）的1.44倍，且与CK及M1、M2、M3、M5间差异达到极显著水平；M5含量次之，为8.05%，极显著高于CK及M1、M2、M3；M1和M2含量分别为6.98%和7.53%，均极显著高于CK和M3。M3含量最低，仅为6.47%，与CK无显著差异。

2.3 可溶性糖含量

由不同荞麦可溶性糖含量图可知（图3），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）可溶性糖含量在9.09%～12.88%之间。含量最高的是M5，为12.88%，是对照（CK）的1.32倍，与M4差异不显著，但极显著高于CK和M1、M2、M3。M4含量次之，为12.56%，是CK的1.29倍，极显著高于CK和M1、M2、M3。M2含量为10.94%，显著高于CK，极显著高于M1和M3。而M1、M3和CK间均无显著差异。

2.4 POD活性

由不同荞麦POD活性图可知（图4），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）POD活性差异较大，变化范围为20.00～71.50 △OD470 /（min·g FW）。活性最高是M5，为71.50 △OD470 /（min·g FW），是对照（CK）的1.81倍、M1的3.58倍、M2的1.91倍、M3的1.89倍、M4的1.27倍，与M4的差异不显著，而与CK及M1、M2、M3的差异均达到极显著水平。M4活性次之，为56.50 △OD470 /（min·g FW），是CK的1.43倍，且与CK及M1、M2、M3的差异达到显著水平。M2和M3活性分别为37.50 和37.83 △OD470 /（min·g FW），两者与CK均无显著差异。M1活性最低，仅为20.00 △OD470 /（min·g FW），显著低于CK及其他突变体。

2.5 CAT活性

由不同荞麦CAT活性图可知（图5），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）CAT活性变化较大，范围为5.50～24.41 mg/（min·g FW）。其中，活性最高是M1，为24.41 mg/（min·g FW），分别是CK、M2、M3、M4、M5的1.41、1.25、4.44、1.44、1.28倍，且与CK及M2、M3、M4、M5的差异均达极显著水平。M2、M5的活性分别为19.59、19.04 mg/（min·g FW），差异不显著，但均显著高于CK，极显著高于M3和M4。M4活性为16.94 mg/（min·g FW），低于CK，但差异不显著。M3活性最低，为5.50 mg/（min·g FW），极显著低于CK及其他突变体材料。

2.6 SOD活性

由不同荞麦SOD活性图可知（图6），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）的SOD变化范围为236.36 ～301.01 unit/g FW。其中，M5活性最高，为301.01 unit/g FW，M4活性较高，为276.77 unit/g FW，两者无显著差异，但均极显著高于CK及M1、M2、M3。M1活性为 276.77 unit/g FW，与CK差异不显著，但均极显著高于M2和M3。M2、M3活性较低，均极显著低于CK。

2.7 总叶绿素含量

由不同荞麦总叶绿素含量图可知（图7），突变体（M1、M2、M3、M4、M5）的总叶绿素含量变化范围为1.42～3.05 mg/g。其中，含量最高的是M5，为3.05 mg/g，是CK的1.96倍，且与CK、M1、M2、M3、M4间的差异均达到极显著水平。M4和M2含量分别为2.35和1.81 mg/g，均显著高于CK。M1含量最低，仅为1.42 mg/g，但与CK和M3间的差异均不显著。

3 讨论

荞麦在抗衰老、抑制脂肪累积、预防心脑血管病、治疗高血压、降血糖及增强机体免疫力等方面有重要的作用[24-27]，其黄酮和蛋白质含量的多少是衡量荞麦品质的重要指标之一[28]。突变体（M1、M2、M3、M4、M5）的黄酮含量在6.47%～9.33%间，远高于刘三才等[29]、黄凯丰等[30]、彭镰心等[31]的研究；蛋白质含量在12.57%～14.58%之间，与刘三才等[29]对贵州、四川、云南苦荞籽粒蛋白质含量测定结果一致。另外，晚熟突变体（M4）的黄酮和蛋白质含量均最高，且极显著高于对照（CK），值得在高品质苦荞资源的开发利用中进一步推广应用。

可溶性糖是植物光合作用的主要产物，是植物体能量的供应基础，与植物的生长发育及抗逆性关系密切[32-33]，含量的高低可作为作物品种抗逆性及产量的筛选指标[34-35]。叶绿素是植物吸收光能进行光合作用的色素，是衡量植物光合能力的一个重要指标[36-37]。大叶突变体（M5）、晚熟突变体（M4）和小粒突变体（M2）可溶性糖和总叶绿素含量均显著高于对照（CK），且大叶突变体（M5）和晚熟突变体（M4）与CK间的差异达到极显著水平。而早熟突变体（M3）和矮杆突变体（M1）与对照（CK）间的可溶性糖和总叶绿素含量均无显著差异。实践中我们发现，大叶突变体（M5）的抗逆性及株高、主茎分支数、株粒数、株粒重、千粒重等均优于对照（CK），农艺性状综合表现极显著高于对照（CK），而晚熟突变体（M4）、早熟突变体（M3）和小粒突变体（M2）除株高和主茎分支数优于对照（CK）外，株粒数、株粒重、千粒重等低于对照（CK），矮杆突变体（M2）株高等农艺性状指标均低于对照（CK）[38]。这说明虽然可溶性糖与植物的生长发育存在一定的关系，叶绿素的含量影响植物的光合能力，但仅仅就可溶性糖和叶绿素含量的高低还不能将其作为荞麦生长发育及荞麦产量的筛选指标。

过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）过氧化氢酶（CAT）是植物体内防御活性氧伤害的保护酶，能有效对植物体内的活性氧进行清除，在保护植物免受伤害等方面起着重要的作用，能反映作物抗逆性的强弱和作为品种抗逆性筛选的评价指标[39-40]。目前有关对荞麦POD活性、SOD活性、CAT活性的研究报道极少，仅发现龚宁等[22]研究了几种荞麦的抗氧化酶活性，发现苦荞的POD活性为16.2 △OD470 /（min·g FW）、CAT活性为45.9 mg/（min·g FW）、SOD活性为199 unit/g FW。而突变体（M1、M2、M3、M4、M5）POD活性为20.00～71.50△OD470 /（min·g FW）、CAT活性为5.50～24.41 mg/（min·g FW）、SOD活性为236.36～301.01 unit/g FW。因此，突变体（M1、M2、M3、M4、M5）的POD和SOD活性高于龚宁等的研究，而CAT活性较低于龚宁等的报道。可能是由所考察的荞麦材料的遗传差异、栽培的气候环境的差异、荞麦发育时期的差异等不同所造成。

本研究还发现，晚熟突变体（M4）和大叶突变体（M5）的蛋白质、黄酮、可溶性糖及总叶绿素含量；POD和SOD活性均优于对照（CK），因此晚熟突变体（M4）和大叶突变体（M5）在荞麦食品、保健品、医药品的开发及荞麦遗传育种中都具有很大的潜力，值得进一步研究和开发利用。而矮杆突变体（M1）、小粒突变体（M2）和早熟突变体（M3）无论是对于对照（CK）来说，还是对于晚熟突变体（M4）和大叶突变体（M5）而言，在某些方面都有其不具备的优势特征，这些优势对于荞麦的进一步开发及利用同样具有重要的意义。

参考文献

[1] 钱前，程式华. 水稻遗传学和功能基因组学[M]. 北京：科学出版社， 2006.

[2] 张晓勤，薛大伟，周伟辉，等. 用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变的大麦浙农大3号突变体的筛选和鉴定[J]. 浙江大学学报（农业与生命科学版）， 2011， 37（2）： 169-174.

[3] 汪念. 甘蓝型油菜EMS突變体的构建及TILLING、 EcoTILLING技术的应用研究[D]. 武汉：华中农业大学， 2009.

[4] 刘录祥，郭会君，赵林姝，等. 植物诱发突变技术育种研究现状与展望[J]. 核农学报， 2009， 23（6）： 1 001-1 007.

[5] Ahloowalia B S， Maluszynski M， Nichterlein K. Global impact of mutation-derived varieties[J]. Euphytica， 2004， 135： 187-204.

[6] 张以忠，陈庆富. 荞麦研究的现状与展望[J]. 种子， 2004， 23（3）： 39-42.

[7] Zhang W. Evaluation of the antioxidant activities of total flavonoids from tartary buckwheat[J]. Med Plants Res， 2012， 6（8）： 1 461-1 467.

[8] 姜涛，孔令聪，王光宇，等. 安徽省苦荞麦种质资源引种观察及鉴定[J]. 农学学报， 2013， 3（7）： 8-10.

[9] 侯雅君，张宗文，吴斌，等. 苦荞种质资源AFLP标记遗传多样性分析[J]. 中国农业科学， 2009， 42（12）： 4 166-4 174.

[10] 李燕群，蒲翔，李春梅，等. 水稻507ys黄绿叶突变体的遗传鉴定与候选基因分析[J]. 中国农业科学， 2014， 47（2）： 221-229.

[11] 张纪元，张平平，姚金保，等. 以EMS诱变创制软质小麦宁麦9号高分子量谷蛋白亚基突变体[J]. 作物学报， 2014， 40（9）： 1 579 -1 584.

[12] 杜丽芬，李明飞，刘录祥，等. 一个化学诱变的小麦斑点叶突变体的生理和遗传分析[J]. 作物学报， 2014， 40（6）： 1 020-1 026.

[13] 刘祥久，刘晓丽. 利用EMS诱发玉米性状变异的效果[J]. 杂粮作物， 2010， 30（2）： 88-90.

[14] 李国柱，董艳辉，申慧芳，等. 苦荞辐照突变体黄酮含量与PAL活性和农艺性状研究[J]. 激光生物学报， 2010， 19（4）： 546-551.

[15] 田小丽. 60Co-γ射线辐照诱发苦荞突变体筛选高黄酮含量的种质资源[J]. 科技情报开发与经济， 2008， 18（23）： 150-152.

[16] Yao Y N， Xuan Z Y， He Y M， et al. Principal component analysis of intraspecific responses of tartary buckwheat to UV-B radiation under field conditions[J]. Environ Exp Bot， 2007， 61（3）： 237-245.

[17] Breznik B， Germ M， Gaberscik A， et al. Combined effects of elevated UV-B radiation and the addition of selenium on common （Fagopyrum esculentum Moench） and tartary [Fagopyrum tataricum （L.） Gaertn.] buckwheat[J]. Photosynthetica， 2005， 43（4）： 583-589.

[18] 王安虎，戴红燕，邓建平. 60Co-γ射线辐射苦荞麦籽粒M2至M5代变异性状不稳定性研究[J]. 杂粮作物， 2005， 25（6）： 364-366.

[19] 张志良，瞿伟箐，李小方，等. 植物生理学实验指导[M]. 4版.北京：高等教育出版社， 2009.

[20] 邓琳琼. 普通荞麦杂种优势研究[D]. 贵阳：贵州师范大学， 2011.

[21] 陈建勋，王晓峰. 植物生理实验指导[M]. 广州：华南理工大学出版社， 2002.

[22] 龚宁，陈庆富，李昌梅，等. 几种荞麦的抗氧化酶活性研究[J]. 广西植物， 2006， 26（1）： 88-91.

[23] 李合生，孙群，赵世杰. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社， 2000.

[24] 张以忠，李晶，邓琳琼，甜荞不同器官水提液体外抗氧化活性研究[J]. 食品与生物技术学报， 2013， 32（9）： 989-994.

[25] 张以忠，李红梅，邓琳琼. 大野荞不同器官水提液清除·OH、 ·O2-和H2O2的比较[J]. 食品与生物技术学报， 2014， 33（8）： 850-855.

[26] 邓琳琼，张以忠. 大野荞不同器官可溶性糖的抗氧化能力[J]. 食品研究与开发， 2016， 37（7）： 23-27.

[27] 闫超，郭军，张美莉，等. 内蒙古荞麦总黄酮含量测定[J]. 粮食与油脂， 2015， 28（2）： 52-54.

[28] 陈庆富. 荞麦生产100问[M]. 贵阳：贵州民族出版社， 2008.

[29] 刘三才，李为喜，刘方，等.苦荞麦种质资源总黄酮和蛋白质含量的测定与评价[J]. 植物遗传资源学报， 2007， 8（3）： 317-320.