1型糖尿病大鼠左心室HCN4表达实验研究

摘 要： 目的探讨4型超极化激活环核苷酸门控阳离子通道在1型糖尿病大鼠左心室的表达.方法腹腔注射链脲佐菌素溶液建立1型糖尿病大鼠模型，通过免疫荧光染色和免疫印记观察HCN4在左心室的表达.结果免疫荧光染色HCN4在大鼠左心室未见表达，免疫印记显示糖尿病大鼠左心室HCN4在蛋白质水平升高（P<0.05）.结论正常大鼠左心室表达HCN4，T1DM左心室HCN4表达升高，导致糖尿病心室电重构可能与室性心律失常发生有关。

关键词：1 型糖尿病 HCN4 左心室

中圖分类号：R587 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2016）12-0257-01

心脏起搏细胞反复除极的离子基础是超级化电流（If），If作为心肌舒张期去极化的主要决定因素在细胞自律性的产生过程中起着重要作用.其形成的分子基础是编码超极化激活的环化核苷酸门控通道（HCN）基因家族，该家族包括HCN1-4四种亚型，心室肌主要表达HCN2，少量表达HCN4.HCN4是控制心率的主要因素.1型糖尿病引发的糖尿病心肌病其发病机制不明，本实验通过T1DM模型观察左心室HCN4在蛋白质水平变化，为探讨1型糖尿病的常见并发症如室性心律失常的发生提供更多理论依据。

一、材料与方法

1.材料 成年健康雄性SD大鼠60只体重（170±20）g.兔多克隆抗HCN4抗体（Alomone公司）、TR标记山羊抗兔IgG二抗（Santa cruz 公司）、Goat Anti-Rabbit IgG/HRP二抗（北京博奥森生物技术有限公司）

2.方法 1.2.1模型制作：动物随机分两组即对照组（20只）和实验组（40只）.两组大鼠普通饮食喂养1w后禁食12h，对照组大鼠腹腔一次性注射不含STZ的柠檬钠-柠檬酸缓冲液，实验组大鼠55mg/kg一次性腹腔注射STZ，3d后取尾静脉血测空腹血糖，血糖≥16.7mmol/L者为糖尿病大鼠.模型成功后均持续喂养3m。1.2.2取材：麻醉后取左心室，部分（对照组10只实验组14只）液氮速冻用作冰冻切片；一部分（对照组10只实验组15只）液氮速冻用于免疫印迹实验。1.2.3免疫荧光染色：LeicaCM1850恒冷冰冻切片机中进行切片厚度10um.一抗HCN4抗体（1：50），二抗TR标记山羊抗兔IgG（1：300），荧光显微镜下观察荧光的分布。1.2.4免疫印迹反应（Western Blot）：两组左心室组织提取蛋白质进行WB分析.兔抗大鼠HCN4（1：400）、兔抗大鼠β-Actin抗体（1：500）作为一抗，辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗（1：2000），ECL显色.用凝胶成像分析仪采集图像及ImageJ图像处理软件进行吸光度分析

3.统计学分析 SPSS14软件进行分析，组间比较采用t检验

二、结果

1.免疫荧光染色：左心室纵切面上两组都未见HCN4的表达。2.2Western Blot：12w时，对照组检测到HCN4蛋白质弱表达，糖尿病组检测到HCN4蛋白质表达明显升高，与对照组相比有显著性差异（P<0.05） （表1、图1和2）

A、B分别代表实验（DM）组和对照组

三、讨论

HCN4是正常起搏电流产生的重要因素对基础心率的维持起重要作用并能随着机体的不同生理状态对频率进行调整.研究证实HCN4通道的异常与某些心脏疾病有关[1]。在心衰或者心肌肥大的病人心室肌HCN4在mRNA和蛋白质水平都增加，室性心律失常时HCN4表达亦上调[2]，我们推断这可能是由If过度表达引起.在老年自发性高血压大鼠模型中发现If表达增多，心室起搏电流是正常鼠的5倍同时HCN4的表达上调，用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂治疗会显著地降低If电流的最大电导，通过抑制If电流，可以减慢心.本实验中通过免疫荧光在心室肌上未见HCN4，Western blot显示正常左心室HCN4 少量表达，1型糖尿病大鼠左心室HCN4表达明显增高，与上述文献报道的其他心脏疾病电重构的变化一致[3]。可见病理情况下HCN4通道在普通工作心肌中表达升高使其具有产生起搏电流的特性，这可能与心律失常发生有关.深入研究病理情况下HCN4的变化对各种心律失常疾病有一定的预防和治疗作用.

参考文献

[1]Lin H，Xiao J，et al.Transcriptional control of pacemaker channel genes HCN2 and HCN4 by Sp1 and implications in reexpression of these genes in hypertrophied myocytes[J].CellPhysiol Biochemm，2009， 23（4-6）：317-26

[2]Wu X，Jiang X，et al.Expression of HCN4 protein in ventricular outflow tract of rabbit with idiopathic ventricular tachycardia[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2015，95（44）：3620-4

[3]王庆志，周立等.1型糖尿病大鼠左心室 HCN2和 HCN4重构[J].中国临床解剖学杂志，2011，29（3）：321-324

作者简介：张丽（1981-）女，湖北潜江市，硕士，助教，心脏基础研究。