吡唑醚菌酯在香蕉中的低温贮藏稳定性试验

赵方方++谢德芳++吕岱竹++张月++林靖凌++吴琼

摘要：对吡唑醚菌酯在香蕉中的低温贮藏稳定性进行了研究，同时建立了吡唑醚菌酯在香蕉中的残留分析方法。结果表明，在0.01～0.10 mg/kg添加范围内，吡唑醚菌酯在香蕉中的平均回收率为82%～97%，变异系数为1.3%～2.7%；方法最小检出量为1×10-10 g，最低检出浓度为0.01 mg/kg。通过样品添加和-20 ℃下低温贮藏的方法，设定采样间隔分别为0、1、3、6及12个月。取样检测显示，吡唑醚菌酯的含量没有明显变化，说明该农药在-20 ℃下的香蕉样品中至少贮藏12个月是稳定的。

关键词：吡唑醚菌酯；香蕉；低温贮藏稳定性；液相色谱

中图分类号：X836 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1537-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.033

Study on the Low Temperature Storage Stability of Pyraclostrobine in Banana

ZHAO Fang-fanga，b，XIE De-fanga，b，LV Dai-zhua，b，ZHANG Yuea，b，LIN Jing-linga，b，WU Qionga，b

（a.Analysis&Testing Center；b.Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China）

Abstract： The low temperature storage stability of pyraclostrobine in banana was studied，and the method for the determination of pyraclostrobine residues in banana was established. Average recoveries of pyraclostrobine in banana were found in the range of 82%～97% at the three spiking levels from 0.01 to 0.10 mg/kg with relative standard deviations of 1.3%～2.7%. The lowest detection limit of instrument for pyraclostrobine was 1×10-10 g，and the limit of quantitation was 0.01 mg/kg. The content of pyraclostrobine was not significantly changed by sample addition and -20 ℃ at low temperature. The sampling interval was 0，1， 3，6 and 12 months. It was showed that the pesticide was stable at least 12 months in the banana samples at -20 ℃.

Key words： pyraclostrobine；banana；low temperature storage stability；HPLC

在農药登记残留试验研究中，样品在分析前会被贮藏一段时间，贮藏条件下的农药残留贮藏稳定性对农药残留分析工作者非常重要，同时它也是农药登记试验数据的重要组成部分[1]。目前农业部拟发行农产品中农药残留贮藏稳定性试验准则，准则中明确规定，农药残留登记试验需要单独提交样品贮藏稳定性试验报告。

随着贮藏时间的延长，很多农药都由于种种原因发生降解，从而导致分析结果的假阳性。但是通常情况下根据经验判断贮藏不会影响试验结果。因此，研究农药低温贮藏稳定性以确保农药残留分析结果在一段贮藏时间内的数据有效性，对于农药残留分析工作者是非常必要的[2]。

目前，关于吡唑醚菌酯农药残留在香蕉中的贮藏稳定性尚未见文献报道。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobine）是由德国巴斯夫公司于1993年开发的兼具吡唑结构的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂[3]，可有效防治多种由真菌病原引起的病害如叶枯病、锈病、白粉病、霜霉病等[4]。现已在中国广泛应用于谷物、蔬菜、水果等作物的病害防治上[5-7]。其中，吡唑醚菌酯在防治香蕉黑星病和叶斑病等病害中发挥了积极作用[8]。目前共有巴斯夫欧洲公司、上海绿泽生物科技有限责任公司等多家公司进行原药、悬浮剂、乳油、水分散粒剂等51个产品登记。吡唑醚菌酯的检测方法主要采用气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱、液相色谱-串联质谱法以及表面等离子体共振生物传感技术等[9-14]。

本研究对吡唑醚菌酯在香蕉蕉肉样品中的农药残留贮藏稳定性进行了试验研究。首先建立了吡唑醚菌酯在香蕉果全蕉、蕉肉中的残留分析方法，方法的灵敏度、精密度和回收率等方面均符合农药残留分析的要求。通过样品添加和-20 ℃下低温贮藏的方法，并且设定采样频率和间隔时间，在不同间隔时间内（0、1、3、6及12个月）进行取样检测，为农药登记残留试验在一段贮藏时间内的数据有效性提供了数据支撑，也为分析工作者对吡唑醚菌酯分析前的贮藏过程提供了一些有意义的数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器设备 Waters高效液相色谱仪（2489紫外检测器）；T18高速均质机（德国IKA集团）；微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；Strata/NH2固相萃取柱（55 μm，70 A）500 mg/6 mL；Carbon/NH2固相萃取柱（55 μm，70 A）500 mg/6 mL；R-210旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；万分之一天平（SHIMAZU）。

1.1.2 被测物质 吡唑醚菌酯标准品（德国Dr.Eh-renstorfer GmbH 公司，纯度99.0%）；准确称取标准品0.01 g，用甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，配成1 000 μg/mL标准储备溶液，0～4 ℃保存，按需稀释，得到标准储备液。

1.1.3 化学试剂 甲醇、乙腈、正己烷、丙酮（色谱纯）。

1.1.4 被测农产品 香蕉品种为巴西蕉。香蕉样本的采集：随机在试验小区内6～12个采样点采集2 kg生长正常、无病害、成熟的香蕉空白果实，切段、混匀后采用四分法留样500 g，装入样本容器中，粘好标签。香蕉样品的制备与保存：田间样本去净表面杂质，剪去果柄，用刀具纵向将香蕉切分成两瓣，用勺子取出蕉肉放入捣碎机，匀浆混匀用四分法缩分，分取250 g樣品两份，分别装入样品容器中，贴好实验室样品标签。田间样本在采集后，8 h内运回实验室，并立即制备成实验室样品冷冻保存。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 稳定性试验需设定质控样品，应保证每次取样有空白样品1个、质控样品1个、贮藏添加样品2个重复。样品中农药的添加水平应为分析方法定量限的10倍。取样检测间隔设定为0、1、3、6及12个月，共贮藏1年时间，每次取出2个重复样品进行检测。根据拟发行的农产品中农药残留贮藏稳定性试验准则，样品只做可食部分样品基质，本研究选择香蕉肉样品进行研究。

1.2.2 空白样品添加方法 称取20.0 g粉碎匀浆过的样品，置于150 mL塑料瓶中，使用0.2 mL移液管吸取0.2 mL 10 μg/mL的吡唑醚菌酯标准溶液，均匀滴加到香蕉样品表面，静置30 min使溶剂缓慢挥发，用玻璃棒将样品与残留农药混合均匀，将塑料瓶用密封盖密封，置于-20 ℃下冷冻贮藏且在黑暗中保存待测（添加后的样品浓度为0.1 mg/kg）。测样同时做空白对照及质控试验（质控样品浓度同添加浓度）。

1.2.3 样品前处理 1）提取。香蕉样品：称取20.0 g粉碎的样品，置于烧杯中，加入40.0 mL乙腈，2 000 r/min高速匀浆2 min后过滤到预装有5～7 g NaCl的具塞量筒（100 mL）中，盖上塞子，剧烈振荡2 min后室温下静置30 min。吸取上清液10.0 mL至100 mL圆底烧瓶中于旋转蒸发仪上蒸发至干，加入5.0 mL正己烷-丙酮（60∶40，V/V）溶解混匀，待净化。

2）净化。吸取5.0 mL正己烷-丙酮（60∶40，V/V）溶液预淋洗Strata/NH2固相萃取小柱，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入待净化液，用100 mL圆底烧瓶收集；用5.0 mL正己烷-丙酮（60∶40，V/V）冲洗圆底烧瓶残留物后淋洗萃取小柱，重复3次。收集液旋转蒸发至干，用2.5 mL甲醇定容后过0.22 μm滤膜待测。

1.2.4 液相色谱条件 液相色谱柱：SunfireTM C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）；紫外检测波长278 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL；流速：1 mL/min；流动相：乙腈-水。梯度洗脱步骤见表1。

1.2.5 准确度与精密度测定 量取一定体积的吡唑醚菌酯标准贮备液加入香蕉蕉肉空白样品中，制得对应质量浓度分别为0.01、0.02、0.10 mg/kg的3个添加水平，每个添加水平5次试验，同时做空白对照，按“1.2.3”进行样品前处理，按“1.2.4”条件进行检测，计算回收率及相对标准偏差。

2 结果与分析

2.1 提取检测条件的选择

吡唑醚菌酯是一种极性农药，20 ℃下，在二氯甲烷中溶解度≥57 g/100 mL，丙酮≥65 g/100 mL，乙腈≥50 g/100 mL；但由于二氯甲烷沸点较低，对环境和试验人员污染较大；丙酮毒性低，但其共萃物较多；因此，选择乙腈作为提取溶剂。吡唑醚菌酯在紫外检测波长278 nm时响应值最大，0.01 μg/mL的标准溶液出峰明显，S/N>3。

吡唑醚菌酯标准品、香蕉空白样品、质控样品以及贮藏添加样品（0个月和12个月）的液相色谱图见图1。样品先以V（乙腈）∶V（水）=65∶35为流动相运行9 min，再调整其体积比为90∶10进行测定，吡唑醚菌酯在香蕉样品中与杂质得到了良好的分离；由图1可知，吡唑醚菌酯保留时间为7.237 min。

2.2 标准曲线及线性范围

用甲醇做溶剂，逐级稀释标准贮备液，分别配成0.010、0.025、0.050、0.100、0.500 μg/mL标准溶液，进样分析，采用外标法峰面积定量。以吡唑醚菌酯浓度x（μg/mL）为横坐标，以相应峰面积y为纵坐标绘制工作曲线。吡唑醚菌酯标准曲线回归方程为y=40 393x+89.712，相关系数为0.999 9（图2）。

2.3 方法准确度和精密度

香蕉样品中添加吡唑醚菌酯的回收率及相对标准偏差的结果见表2。由表2可知，3个添加水平在香蕉中平均回收率为82%～97%，相对标准偏差为1.3%～2.7%。回收率以及相对标准偏差均在农药残留试验准则允许范围内[15]，方法的准确度和精确度可满足吡唑醚菌酯残留检测的要求。

2.4 最低检出量与方法定量限

以一定量的吡唑醚菌酯标准溶液进样，以3倍信噪比所需的待测物浓度计算（进样量10 μL），吡唑醚菌酯最小检出量为1×10-10 g。在香蕉空白样品中添加一定量的吡唑醚菌酯标准溶液，按10倍信噪比所需的待测物浓度计算（以mg/kg为单位），方法定量限为0.01 mg/kg，完全满足香蕉中吡唑醚菌酯农药残留限量的检测要求（GB 2763-2014中规定吡唑醚菌酯在香蕉中的最大允许残留限量为0.02 mg/kg）。

2.5 低温贮藏试验结果

香蕉果肉的低温贮藏试验结果见表3，每个样品重复2次。由表3可知，对于贮藏在-20 ℃下的吡唑醚菌酯香蕉样品，随着贮藏时间的增长农药有效成分含量稍有差异但并没有明显减少。这可能是由于-20 ℃的贮藏温度相当低，样品中的微生物活动能力大大被限制，导致吡唑醚菌酯未被降解；其中不同间隔时间测得的农药含量的微小差异很可能是由于农药自身的物化性质以及每次前处理试验中试验试剂批次不同、仪器状态稍有差异、人为操作等不可避免的因素造成的。

3 结论

建立了吡唑醚菌酯在香蕉中的残留分析方法，方法的靈敏度、精密度和回收率等方面均符合农药残留分析的要求。通过样品添加和-20 ℃下低温贮藏的方法，设定采样频率和间隔时间，在不同间隔时间内（0、1、3、6及12个月）进行取样检测。结果显示，吡唑醚菌酯在香蕉蕉肉样品中非常稳定，农药含量没有明显变化，说明该农药在-20 ℃下的香蕉蕉肉样品中至少贮藏12个月是稳定的。

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