离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎与仔鱼的毒性

南平++燕帅国++王亚星++韩晓++张岩晨++杜启艳++常重杰

摘要：为了研究离子液体[C16mim]Cl的生物毒性作用，以泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）胚胎和仔鱼为受试动物，分别以胚胎发育的囊胚期、原肠胚期、神经胚期和尾芽期4个发育时期以及孵出期和孵出3 d的仔鱼作为处理的起始点进行急性毒性试验。结果显示，随着[C16mim]Cl浓度的增加和处理时间的延长，泥鳅胚胎的孵化率逐渐下降，畸形率则在逐步升高；其中，刚孵出的仔鱼24 h与48 h的半数致死浓度（LC50）及安全浓度（SC）分别为0.555、0.453、0.091 mg/L；孵出3 d的仔鱼24 h与48 h的LC50及SC分别为0.444、0.273、0.031 mg/L。表明在较低剂量内，离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎及其仔鱼的发育表现出明显的致畸与致死作用，并且该毒性作用具有显著的剂量-效应关系。

关键词：泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）；胚胎发育；仔鱼；[C16mim]Cl；毒性

中图分类号：S966.4：X52 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）08-1518-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.08.028

Study on the Toxicity Effect of [C16mim]Cl to Misgurnus anguillicaudatus

Embryos and Larvae

NAN Ping，YAN Shuai-guo，WANG Ya-xing，HAN Xiao，ZHANG Yan-chen，DU Qi-yan，CHANG Zhong-jie

（College of Life Sciences， Henan Normal University， Xinxiang 453007， Henan， China）

Abstract： The toxic effect of chloride-1-sixteen alkyl-3-methylimidazolium chinook（[C16mim]Cl） to the embryos and larvae of Misgurnus anguillicaudatus Cantor was studied. The M. anguillicaudatus were exposed to [C16mim]Cl from the beginning of different stages including the embryonic development of blastoderm， mid-gastrula， neurula and tail bud stage， and the larval of hatching period and 3 days after hatching. The results showed that the hatching rate of M. anguillicaudatus embryos decreased and the abnormality of M. anguillicaudatus embryos increased with the increase of[C16mim]Cl treatment time and treatment concentration； and a significant dose-response relationship was observed. The 24 h-LC50， 48 h-LC50 and SC of the newly hatched larvae were 0.555，0.453 and 0.091 mg/L respectively； whereas， the 24 h-LC50， 48 h-LC50 and SC of the 3-day-old larvae were 0.444， 0.273 and 0.031 mg/L. The above results showed that [C16mim]Cl had obvious teratogenic and lethal effect to the embryos and larvae of M. anguillicaudatus.

Key words： Misgurnus anguillicaudatus Cantor； embryonic development； larvae； [C16mim]Cl； toxicity

離子液体因其蒸汽压非常小、不挥发，在使用、储藏中不会蒸发散失，并且可以被循环利用，曾被认为是理想的“绿色溶剂”[1]。但近年来的研究却发现，有些离子液体具有较强的生物毒性[2，3]，例如疏水性离子液体在去除水中重金属的过程中，形成的离子液体与重金属混合物对青海弧菌的毒性要大于重金属的毒性，并且离子液体相互混合物毒性大于离子液体与重金属混合物的毒性[3]。此外，由于离子液体在研发、合成与使用的过程中，极有可能被释放到环境中，尤其是水环境中，因而水生生物作为受试动物所取得的试验结果对离子液体生物毒性确认具有较强的说服力。泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）属鲤形目（Osteichthyes）鳅科（Cobitidae）泥鳅属（Misgurnus Lecepede），是常见的淡水鱼类。由于其分布较广、个体较小、取材方便、饲养容易、对环境污染物反应灵敏等特点，因而在毒性试验研究中，是理想的水生生物实验材料[3]。研究资料表明，鱼类的胚胎是其整个生活史中对各种药物最为敏感的时期，因此可以利用其胚胎期和仔鱼期的敏感性来评价多种化合物及各种环境的毒性[4-7]。试验以泥鳅胚胎发育的4个时期（囊胚期、原肠胚期、神经胚期、尾芽期）以及孵出期和孵出3 d的仔鱼为试验对象，研究了离子液体对水生生物的毒性影响，以期为离子液体的合理研发与使用提供一定的参考，也为水卫生标准及渔业用水水质标准的制定提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

参试泥鳅购自新乡市鸿达市场，选择大小相近、健康活泼、体重20～30 g、平均体长13～17 cm的健壮泥鳅，试验前驯养一周，每天更换1次曝气24 h的自来水。离子液体[C16mim]（氯化1-十六烷基-3-甲基咪唑，chloride-1-sixteen alkyl-3-methylimidazolium chinook，分子式：C20H39ClN2，分子量：343.01）购自上海成捷化学有限公司，纯度>99%；兽用绒毛膜促性腺激素（HCG）购于新乡市兽药店。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的制备 在生殖季节，选取性成熟的雌、雄泥鳅各10尾，采用背部肌肉注射法注射兽用绒毛膜促性腺激素，其中雌鱼为800 IU/尾；雄鱼注射剂量减半。10～14 h后，轻压雌鳅腹部，立即将卵收集于不同的培养皿中，干法受精[4]，获得的受精卵备用。

1.2.2 处理 在前期预备试验的基础上，设置0.16、0.24、0.36、0.54、0.81 mg/L共5个[C16mim]Cl处理和1个空白对照处理，每处理均设3个平行样，置于直径12 cm的培养皿中（100个受精卵/培养皿）。在胚胎染毒组，以0.16～0.81 mg/L共5个[C16mim]Cl处理浓度的离子液体溶液（100 mL/培养皿），分别于囊胚期、原肠胚期、神经胚期和尾芽期开始染毒处理；而对仔鱼孵出期和卵黄吸收期同样选择0.16～0.81 mg/L共5个[C16mim]Cl处理（100 mL/培养皿）进行染毒处理；每24 h更新其相应的处理液、及时剔除死亡个体，并利用解剖显微镜连续观察其发育状况，并及时拍照、记录。其中仔鱼各处理在处理 48 h后终止试验（仔鱼卵黄囊吸收完毕后，每天上、下午各投喂1次蛋黄）。根据文献[7]计算出各处理的胚胎孵化率、畸形率及仔鱼半数致死浓度，并推算出相应的安全浓度。

1.3 数据处理

试验所得数据采用Microsoft Office Excel 2003程序处理，并用其制表和绘图；运用SPSS16.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎致畸症状表现、孵化率、畸形率的影响

离子液体[C16mim]Cl使泥鳅胚胎、仔鱼致畸的症状表现见图1，对泥鳅胚胎孵化率、畸形率的影响情况图2。从图1可见，胚胎的主要致畸症状表现为受精卵发育异常，如胚盘异常凸起（图1-A）；胚盘下包异常（图1-B）；胚体浑浊或自行解体（图1-C）；卵黄吸收异常，如卵黄膨大、崩解等（图1-D）。从图2可见，随着[C16mim]Cl离子液体浓度的增加，泥鳅胚胎孵化率下降，畸形率上升，具有明显的剂量-效应关系。对4个胚胎发育期试验结果比较后，发现泥鳅胚胎经相同浓度离子液体[C16mim]Cl处理后的孵化率由低到高依次为囊胚期、原肠胚期、神经胚期、尾芽期；除了囊胚期外，泥鳅胚胎的孵化率无明显差异，即离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎影响的敏感性大致相同；只有囊胚期在处理后，胚胎的孵化率明显下滑，即囊胚期处理可明显降低泥鳅胚胎的孵化率，说明该时期是离子液体[C16mim]Cl对泥鳅胚胎影响最敏感的时期，且对剂量具有一定的依赖关系。而在畸形率方面，剂量效应关系更加明显，其中在神经胚期和尾芽期尤为突出。

2.2 离子液体[C16mim]Cl对泥鳅仔鱼死亡率的影响

观察发现，在离子液体[C16mim]Cl处理1～2 h时，泥鳅仔鱼活动开始加快。随着处理时间的进一步延长，仔鱼表现出明显的致畸症状，如弯体或弯尾等（图1-E），且其摄食能力明显降低，最终死亡。离子液体[C16mim]Cl对泥鳅仔鱼死亡率的影响见表1。从表1可见，[C16mim]Cl浓度越高，泥鳅仔鱼的死亡率越大，具有一定的相关性。处于孵出期与孵出3 d后的仔鱼对离子液体[C16mim]Cl的耐受性不同，两者相比较，孵出期仔鱼的24 h和48 h半数致死浓度及安全浓度分别为0.555、0.453、0.091 mg/L，孵出 3 d的仔鱼其24 h和48 h半数致死浓度及其安全浓度分别为0.444、0.273、0.031 mg/L。由此可知，孵出期泥鳅仔鱼对离子液体[C16mim]Cl的耐受性要强于孵出3 d的仔鱼。

3 讨论

离子液体因具有微乎其微的蒸气压、在使用过程中本身不会形成挥发性有机物及易于回收利用的特性而被众多学者普遍认为是“绿色溶剂”[1]。然而，近年来关于离子液体生物毒性研究的报道日趋增多[8，9]。研究发现，离子液体的毒性大小主要与其阳离子有关，而其阴离子则对其无明显影响；并且同一类型的离子液体其毒性大小与阳离子碳链大小呈正相关[10]。此外，有学者认为，离子液体具有脂溶性，可能在动物体内逐步积累，从而进入细胞，影响细胞代谢，并产生毒性[11]。

试验采用不同浓度（0.16、0.24、0.36、0.54、0.81 mg/L）的离子液体[C16mim]Cl处理泥鳅胚胎发育4个时期（囊胚期、原肠胚时期、神经胚期、尾芽期）的胚胎，通过分析各处理中胚胎孵化率和畸形率的变化趋势来评估离子液体[C16mim]Cl对受试胚胎发育的影响，结果显示，在较低浓度范围内，离子液体[C16mim]Cl就能够诱使泥鳅胚胎的孵化率明显降低，使畸形率快速上升，表现出明显的剂量-效应关系。此外，囊胚期处理后胚胎的畸形率最低，相比其他時期对离子液体[C16mim]Cl具有一定的耐受性。分析原因，可能与卵膜的保护作用有关，因为胚胎期的卵膜具有选择透性及对毒物的天然屏障作用，试验结果与王君等[4]报道的苏丹红Ⅲ对泥鳅发育的毒性研究结果一致。在神经胚期和尾芽期处理后的畸形率又高于囊胚期和原肠胚期，原因可能是神经胚期正处于胚胎高度分化期，当高度分化胚胎的某部分发生异常变化后，导致将来形成的某些组织或器官异常，形成畸形个体；而尾芽期是许多器官原基形成的时期，例如体节和神经管等，因此易受外界物质影响，而且其距孵出期比较短，其卵细胞膜的保护作用有所减弱。同时，不同时期胚胎的敏感性存在一定的差异。

此外，试验还测试了离子液体[C16mim]Cl对泥鳅孵出期仔鱼和孵出3 d的仔鱼急性毒性效应，发现孵出期和孵出3 d的仔鱼敏感性不同，孵出期仔鱼对离子液体[C16mim]Cl的耐受性要强于孵出3 d的仔鱼。原因可能是早期幼鱼（卵黄吸收期的仔鱼，孵出1～3 d）营养供给主要是靠卵黄提供，受外界的影响并不大。由于离子液体[C16mim]Cl的分子结构与阳离子表面活性剂的结构相似，所以它能与细胞膜上的蛋白质作用，从而破坏细胞膜结构，或增大细胞膜的渗透性；随着仔鱼与毒物充分接触，其效应增强，从而表现出仔鱼对离子液体[C16mim]Cl更加敏感[12，13]。

不过试验只是初步研究了离子液体[C16mim]Cl对泥鳅不同胚胎发育时期及仔鱼不同发育阶段的毒性作用效应，但离子液体[C16mim]Cl对泥鳅的胚胎及其仔鱼的发育毒性作用机制还不明确，有待下一步试验探寻。

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