藏药臭蒿及其近缘种药材的ITS2 DNA条形码鉴别

任瑶瑶　江南屏　刘睿颖　宋良科　谭睿　顾健

[摘要] 臭蒿Artemisia hedinii有清熱凉血，退黄，消炎的功能，在藏药中占有重要地位。蒿属植物种类繁多，在青藏高原分布广泛，且其外形较为相似，传统鉴定方法难以准确快速鉴定。文章以ITS2序列为DNA条形码，建立了一种快速准确鉴定臭蒿及其易混蒿属藏药植物的方法。从青藏高原采集蒿属藏药21个样品，分别提取样品DNA，对ITS2目标序列进行PCR扩增、测序，获得其ITS2序列信息；并从GenBank上下载同属序列11条；运用MEGA 6.0对所有32条ITS2序列进行对比，计算种间种内遗传距离，构建Neighbor Joining（NJ）系统进化树，并比较样本ITS2序列间的二级结构差异。结果显示：臭蒿、牛尾蒿、黄花蒿、艾蒿的遗传距离较近，但四者种间最小距离均远大于种内最大距离，NJ树显示4种蒿属植物种内之间各单独形成一个分支，ITS2序列二级结构也显示出差异。以ITS2序列作为DNA条形码，可达到对臭蒿及其近缘蒿属藏药植物进行准确、快速的识别和鉴定的目的，准确地弄清物种之间的系统进化关系的目的，为该属药用植物的质量控制、安全用药及合理开发利用提供理论依据。

[关键词] 臭蒿； 藏药； DNA条形码； ITS2； 二级结构； 鉴定； 资源利用

ITS2 sequence analysis and identification of medicinal Artemisia plants

REN Yaoyao1， JIANG Nanping1， LIU Ruiying1， SONG Liangke1， TAN Rui1*， GU Jian2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China；

2. School of Pharmacy， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041， China）

[Abstract] Artemisia hedinii occupies an important position in the Tibetan medicine. Plants in Artemisia vary a lot and are widely distributed in the QinghaiTibet Plateau， many plants in Artemisia look similar， making traditional identification methods laborious. In this article， ITS2 sequences were used as DNA barcoding to identify four kinds of confusable Tibetan medicine plants in Artemisia， aiming to establish a rapid and accurate identification methods. Twentyone samples in Artemisia were collected from the QinghaiTibet Plateau， ITS2 sequence PCR amplification and sequencing were conducted after the extraction of DNA. Another 11 sequence downloaded from Genbank were added to the analysis. Genetic distance calculation and analysis， building Neighbor Joining （NJ） phylogenetic tree were conducted by MEGA 6.0， also comparison of secondary structures of ITS2 sequences among samples. A. hedinii， A. annua， A. dubia and A. argyi shared close genetic distance， but the maximum distance between the four species was much greater than the minimum distance within each species， NJ tree showed that the four species went to four separate branches， differences among secondary structures of ITS2 sequences also made it clear to identify these medical plants. It could be an accurate and rapid method for identification and recognition， as well as the evolutionary relationships between the species by using ITS2 sequence as DNA barcode for plants of Tibetan Artemisia. The study provides theoretical basis for quality control， medication safety and rational exploitation.

[Key words] Artemisia hedinii； Tibetan medicine； DNA barcode； ITS2； secondary structure； identification； resource utilization

藏药是中华民族医药的一块瑰宝，主要分布在青藏高原，藏药植物资源种类繁多，其使用历史悠久、疗效确切、文化底蕴深厚，引起了广泛关注。我国蒿属植物种类繁多，据《中国植物志》载：蒿属植物全球约300 余种，我国有186 种，44 变种，遍布全国[1]。多种蒿属植物具有重要的经济价值，可供食用、药用、防风固沙等用途，且多为著名的藏药，其根或全草入药[23]。蒿属藏药植物的主要化学成分是挥发油、萜类、黄酮类、香豆素类、色原酮类等。现代药理学研究表明，蒿属藏药植物多具有清热解毒、抗菌消炎、祛风除湿、通经活络、活血、止血等功效 [48]。蒿属藏药在青藏高原分布广泛，青藏高原东缘藏药植物长期生存于高海拔、强辐射、大温差、高寒缺氧、无染污的高原地理环境中，所含药物的活性成分较高[9]，具有较高的药用价值。

臭蒿Artemisia hedinii首见于《中国民族药志》，藏药名桑子那布，有清热凉血，退黄，消炎的功能，主治“赤巴”病，急性黄疸性肝炎，胆囊炎等[10]，藏医谓之上品，在藏药中占有重要地位，在青海多作为牛尾蒿习用。牛尾蒿A. dubia Wall.为藏医常用的药材，藏药名普尔芒那保，是菊科植物牛尾蒿和无毛牛尾蒿的干燥地上部分，主要分布于内蒙古、四川、甘肃、云南和西藏等地。具有清热解毒，杀虫利湿的功效，用于虫病，疫疽，皮肤病和咽喉疾病等的治疗[1112]。黄花蒿A. annua，藏药名克朗，全草味苦，具清热解毒，凉血消肿，退虚热，解暑，止血，治结核病潮热、疟疾、伤暑低热无汗、浮肿，各种出血等[13]。

因形态上的相似，蒿属藏药材易被混淆，而臭蒿、牛尾蒿等蒿属药材在藏药中占有较重要地位，因此对其进行准确鉴定很有必要。DNA条形码技术是通过测定植物DNA序列进行比较来反映其遗传差异，以进行物种分类和鉴定[14]。ITS2 序列是位于nrITS 序列上5.8～26S核糖体DNA 的转录间隔区，包含5.8S 和26S 两端的保守区，该序列最早被应用于系统发育和物种的分类研究中[1517]，ITS2序列包含丰富的变异位点和信息位点，可以用于物种鉴定，对植物有较高的鉴别能力[1820]。采集青藏高原的蒿属藏药臭蒿、黄花蒿、艾蒿、牛尾蒿为样本，以ITS2序列作为DNA条形码，对其进行鉴定以弄清几种蒿属植物之间的系统进化关系，以期建立一种快速准确鉴定蒿属藏药的方法，这将对蒿属藏药的深入研究、资源保护和安全利用具有重要的理论和实践价值。

1 材料

从四川省（阿坝、甘孜州）、青海、甘肃、西藏等地收集蒿属藏药植物或药材样品21份，其中臭蒿A. hedinii样品13份，牛尾蒿A. dubia样品3份，艾蒿A. argyi样品3份，黄花蒿A. annua样品2份，经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授鉴定，保存于西南交通大学标本室，样本来源及其ITS2序列信息见表1。同时在GenBank数据库中下载蒿属植物ITS2序列11条（臭蒿样品1条，牛尾蒿1条，艾蒿样品3条，黄花蒿6条），ITS2序列信息见表2。

2 方法

2.1 样品 DNA提取、PCR扩增及测序 取药材干重组织约30 mg，加入液氮充分碾磨，使用植物DNA提取试剂盒（Tiangen Biotech Co.，China）提取总DNA。以样品DNA作为模板，对ITS2进行PCR扩增，正向引物ITS2F，5′ATGCGATACTTGGTGTGAAT3′；反向引物ITS3R，5′GACGCTTCTCCAGACTACAAT 3′。PCR反应体系参照PCR反应试剂盒（TaKaRa 宝生物工程大连有限公司）的说明。PCR反应条件：①94 ℃变性5 min；②94 ℃变性30 s；③56 ℃退火30 s；④72 ℃延伸7 min；⑤重复上述步骤40次；⑥72 ℃延伸10 min。将PCR产物送至北京梓熙生物科技有限公司进行测序。

2.2 数据处理 采用 CodonCode Aligner 对所得序列峰图进行校对拼接，去除引物区和低质量的序列，由基于隐马尔可夫模型（HMMer）的注释方法切除ITS2两端的5.8S和28S区域，获得标准的ITS2间隔区序列[21]。所有ITS2序列用MEGA 6.0比对[22]，分析种内、种间的遗传变异[23]、利用Wilcoxon双样本进行统计检验，采用相似性搜索法（BLAST1）和最小距离法（nearest distance）考察ITS2序列的鉴定成功率，计算K2P（Kimura 2parameter）遗传距离、构建Neighbor Joining（NJ）系统进化树[24] ，根据Koetschan等[25]建立的ITS2数据库网站预测ITS2序列的二级结构。

3 结果

3.1 种内种间的变异分析 臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黄花蒿ITS2序列長度均为225 bp、GC量54.2%～56.9%，平均GC量为55.3%，见表1。应用MEGA 6.0软件对样品进行多序列比对，比对后的序列长度为225 bp。MEGA 6.0分析显示，13个不同来源的臭蒿样品可分为4个序列类型，其中5个样品为A1型，与KU366642相同，1个A2型，3个A3型，4个A4型；艾蒿、牛尾蒿、黄花蒿样品分别仅有1个系列类型，种间最多23个变异位点，见图1。

3.2 K2P遗传距离分析 研究发现物种间种内距离越小、种间距离越大越适合条形码鉴定[16]。利用MEGA 6.0软件计算臭蒿、牛尾蒿、黄花蒿、艾蒿种内和种间遗传距离，见表3。结果可以看出，臭蒿、牛尾蒿、黄花蒿、艾蒿种内种最大遗传距离为0～0.004，种间最小遗传距离为0.023～0.062，种间最小距离均远大于种内最大距离，利用ITS2序列作为条形码可将四者区分开。

3.3 NJ树分析 根据ITS2序列对所有样本构建NJ系统聚类树，见图2，利用bootstrap 1 000次检验各分支的置信度。从NJ进化树图可以看出，臭蒿、牛尾蒿、黄花蒿、艾蒿各样本种内之间各单独形成一个分支。牛尾蒿与艾蒿与臭蒿亲缘关系较远，臭蒿和黄花蒿的亲缘关系较近，在NJ树上聚为一大支，但分支之间bootstrap置信度在70%以上，物种之间可明显区分开。3.4 ITS2二级结构的分析 根据Koetschan等建立的ITS2数据库及其网站预测的臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黄花蒿ITS2二级结构见图3，从样本的二级结构中可以看出臭蒿、牛尾蒿、艾蒿、黄花蒿的ITS2序列二级结构较为相似，均为一个中心环（主环）及4个螺旋区（helix）组成，每个螺旋上又有大小不同数目各异的茎环（loop）结构。艾蒿在螺旋Ⅲ区上茎环（loop）数量不同，在中部位置多出1个茎环，Ⅰ区颈环结构也有不同。牛尾蒿ITS2序列二级结构在Ⅲ区的茎环结构较其他三者明显不同。臭蒿与黄花蒿ITS2序列二级结构极为相似，从结构上无法将臭蒿与黄花蒿区分开，但结合K2P遗传距离和NJ树可将二者区分。

4 结论

蒿属植物在青藏高原分布相对丰富，其药用价值也较高，是我国藏药植物的主要类群。近年来随着以不可持续的方式进行的乱采滥挖，许多有较高药用价值的蒿属藏药植物的种群数量急剧减少[2627]。对实验材料进行鉴定可以有效保证研究的科学性，使分离出新化合物或发现具有独特药理活性的成分或毒性成分等结果更加可靠，避免因物种问题造成结论错误或无法重复等现象发生[28]。因此蒿属藏药资源的快速准确地识别和鉴定，无疑对蒿属药材的安全使用使用和蒿属藏药资源的合理开发及保护都十分必要。

ITS2 序列对植物具有良好的扩增成功率和物种水平的鉴定成功率[30]，以ITS2 序列作为DNA条形码对蒿属植物的鉴定进行研究可以达到即快速又准确。结果显示ITS2 序列对蒿属植物臭蒿、牛尾蒿、黄花蒿、艾蒿具有较好的鉴定效果。无论从臭蒿及其近缘蒿属药材种内、种间遗传距离，还是基于ITS2条形码序列构建的NJ树，均证实ITS2条形码序列能够准确鉴别臭蒿及其蒿属近缘种药材。四者ITS2序列二级结构差异较小，特别是臭蒿和黄花蒿极为相似，但结合遗传距离和NJ树仍可将二者区分开。分析不同地域的臭蒿样品ITS2序列发现，臭蒿样品的ITS2序列信息变化与其产地的不同并无关联。因样品采集数量有限，不能发现臭蒿样品的ITS2序列信息与产地和海拔之间的关系，或是不同产地和不同海拔臭蒿之间的进化关系。今后的研究中将着重研究资源的种型分布与地域、海拔以及相关环境之间的关系以及不同地域之间的植物资源进化关系，为药物资源的开发和保护提出新的思路和方法。

臭蒿作为具有清热凉血、退黄、消炎作用的藏药在青藏高原地区经常与同为藏药的蒿属药材牛尾蒿混用，但牛尾蒿主要用于清热解毒、杀虫利湿、虫病、疫疽以及皮肤病和咽喉疾病，二者药效和功能都相差较远，且研究表明二者化学成分也有较大差异[30]，因此为臭蒿和牛尾蒿在藏药使用中应准确区分，建立快速识别和鉴定臭蒿药材及其他因与其外形相似的蒿属藏药材对藏药的正确、安全使用具有极大意义。辛天怡等[31]将二维DNA条形码应用于中药材鉴定，对中药材流通的数字化监管的思路可借鉴到对藏药资源的监管中，特别是对某些易混藏药材以及民间错误使用的藏药材进行引导规范，对藏药材的质量监督和安全使用具有积极意义。同时建立藏药材和传统中药材的二维DNA条形码，可进一步研究藏药材和传统中药材的区别与联系，对比藏医和传统中医的用药习惯，深化藏医和传统中医的交融。

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[责任编辑 吕冬梅]