辛伐他汀对胰腺癌BxPC-3细胞株Shh相关蛋白的影响

费洪新 张晓杰 张英博

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

·基础研究·

辛伐他汀对胰腺癌BxPC-3细胞株Shh相关蛋白的影响

费洪新 张晓杰 张英博

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

目的 探讨辛伐他汀对胰腺癌BxPC-3细胞株Shh相关蛋白的影响。方法 胰腺癌BxPC-3细胞株随机分成对照组，5-氟尿嘧啶(5-FU)组(50 μmol/L)，辛伐他汀高、中、低剂量组(20，10，5 μmol/L)。采用台盼蓝染色法和MTT法检测胰腺癌BxPC-3细胞株的生长曲线和增殖抑制率；采用细胞划痕法检测胰腺癌BxPC-3细胞株运动能力；采用免疫组织化学、RT-PCR法检测胰腺癌BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平。结果 与对照组比较，5-FU组，辛伐他汀高、中剂量组胰腺癌BxPC-3细胞OD值、运动能力和Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平明显降低(P<0.05)。结论 辛伐他汀通过抑制BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1水平在胰腺癌治疗中发挥积极作用。

辛伐他汀；胰腺癌；BxPC-3细胞株

研究显示，通过减弱肿瘤细胞增殖相关的Hedgehog信号通路活化水平可以抑制胰腺癌(PC)细胞增殖〔1〕，Hedgehog信号通路还参与介导PC和胰腺组织纤维化〔2〕，调控PC干细胞的分化〔3〕；使用Hedgehog信号通路抑制剂SANT1可以下调Hedgehog信号通路活化〔4〕，在PC中Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Gli1蛋白表达上调，出现Hedgehog信号通路活化〔5〕，可见在PC中Hedgehog信号通路相关的Shh、Ptch1、Gli1蛋白表达失调。另外研究表明，辛伐他汀可以增加紫杉醇的抗肿瘤活性〔6〕，辅助橙皮苷治疗类风湿关节炎〔7〕，降低心肌梗死患者并发肺炎的发生率〔8〕，降低C-反应蛋白和白细胞介素-6水平而有利于慢性心力衰竭患者的康复〔9〕，诱导体外培养非小细胞肺癌细胞凋亡〔10〕，抑制肝癌细胞生长〔11〕，减缓肾癌的细胞增殖〔12〕。虽然辛伐他汀的临床应用较为广泛，但是中国知识资源总库(CNKI)、美国国家生物技术信息中心(NCBI)等数据库显示，辛伐他汀对PCBxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达的研究尚无相关文献报道。基于此，本实验旨在探讨辛伐他汀对BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白的影响。

1 资料与方法

1.1 药物和细胞株 辛伐他汀(宜昌长江药业有限公司，批号0021509002)，5-氟尿嘧啶(FU)(Sigma公司)，人原位BxPC-3细胞株(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.2 试剂与仪器 兔抗人Shh多克隆抗体、兔抗人Gli1多克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，兔抗人Ptch1多克隆抗体、兔抗人Smo多克隆抗体(美国Abcam公司)，其他试剂均为国产分析纯。CO2培养箱(力康发展公司)，胎牛血清(HyClone公司)，HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)，RPMI-1640培养基、胰酶(HyClone公司)，实时定量PCR检测仪(美国伯乐公司)，6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)，Trizol试剂盒、DEPC(上海生工生物工程)等。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 参考文献〔13〕进行人原位BxPC-3细胞株的培养，人原位BxPC-3细胞株在5%CO2、37℃无菌培养箱中正常培养，BxPC-3细胞株恢复生长至对数生长期后冻存，在液氮中保存人BxPC-3细胞株，开始预实验。正式实验开始复苏人BxPC-3细胞株，用含10%胎牛血清、RPMI1640培养液于培养瓶中传代培养，观察人BxPC-3细胞株的基本状态，人BxPC-3细胞株均处于对数生长期后开始指标测定。

1.3.2 细胞分组和用药干预 生长旺盛的人BxPC-3细胞株随机分成对照组，5-FU组(50 μmol/L)，辛伐他汀高、中、低剂量组(20，10，5 μmol/L)。

1.4 观察指标

1.4.1 台盼蓝染色检测人BxPC-3细胞株的生长曲线 利用台盼蓝可以穿透死亡或者坏死细胞的细胞膜并结合DNA的特点，从而鉴定出活细胞。实验取对数生长期人BxPC-3细胞株，胰酶消化，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，制备人BxPC-3细胞株的细胞悬液，调整细胞的浓度为1×104个细胞/ml，选择300 μl接种在24孔培养板，培养1 d，使用辛伐他汀(20、10、5 μmol/L)、5-FU(50 μmol/L)进行干预，模型组加上正常培养基，5%CO2、37℃的无菌培养箱培养1、2、3、4、5、6、7 d。每日取单细胞悬液，按照单细胞悬液与台盼蓝的比例9∶1加入台盼蓝(4%)混合，3 min内计数，收集数据统计分析，绘制各组人BxPC-3细胞株的生长曲线。

1.4.2 噻唑蓝比色法(MTT)检测人BxPC-3细胞株的增殖抑制率 取各组对数生长期人BxPC-3细胞株，胰酶消化，PBS洗涤3次，制备人BxPC-3细胞株的细胞悬液，调整细胞的浓度为2×105个细胞/ml，人BxPC-3细胞株接种于96孔培养板；1 d后，辛伐他汀不同剂量进行干预，5%CO2、37℃无菌培养箱培养3 d，加入10 μl的MTT(5 mg/ml)及二甲基亚砜(DMSO)100 μl，摇床震荡5 min，酶标仪在波长为490 nm处检测各孔的吸光度(OD)，按照公式计算人BxPC-3细胞株的增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.4.3 细胞划痕法检测人BxPC-3细胞株的运动能力 取对数生长期人BxPC-3细胞株，胰酶消化，PBS洗涤3次，制备人BxPC-3细胞株的细胞悬液，浓度为5×105个细胞/ml。黑色笔在6孔培养板的背后，每隔0.8 cm左右划横线，每孔至少穿过3条线。在每孔中加入人BxPC-3细胞株约5×105个细胞/ml，培养1 d后，垂直于背后，使用横线画划痕。用PBS洗涤细胞3次/孔，去除划下的人BxPC-3细胞。对照组加入正常完全培养基、5-FU组加入含有5-FU 50 μmol/L的完全培养基，辛伐他汀高、中、低剂量组分别加入含有辛伐他汀(20、10、5 μmol/L)的完全培养基，继续培养2 d。按0、24、48 h取细胞样品，拍摄划痕处，测量人BxPC-3细胞划痕间的距离，使用人BxPC-3细胞的愈合百分比客观评价人BxPC-3细胞的运动能力。愈合百分比(%)=(1-48 h划痕距离/0 h划痕距离)×100%。

1.4.4 免疫组化(IHC)检测人BxPC-3细胞Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达 选择人BxPC-3细胞株，胰酶消化，收集人BxPC-3细胞，离心后接种到载玻片中，待人BxPC-3细胞贴壁后，选择各组载玻片。PBS冲洗人BxPC-3细胞3次，柠檬酸缓冲液中修复，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗，放入湿盒内4℃过夜，PBS冲洗3次，滴加二抗，放入37℃电热温箱中30 min，PBS冲洗3次，0.05%DAB+0.03%H2O2显色10 min，苏木素5 min复染，PBS洗涤，盐酸酒精(0.5%)分化数秒，梯度乙醇脱水，二甲苯透明数秒，树胶封片，镜下观察，计数人BxPC-3细胞的光密度值，并用HMIAS高清晰度彩色医学图文系统进行分析。

1.4.5 实时定量PCR(RT-PCR)法检测人BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1 mRNA的表达 按Trizol抽提试剂盒说明书提取细胞总RNA并计算浓度。设计引物Shh(上游5′-GCT CGG TGA AAG CAG AGA ACT-3′，下游5′-CCA GGA AAG TGA GGA AGT CG-3′)，Ptch1(上游 5′-CTC CTT TGC GGT GGA CAA-3′，下游5′-CCT CAG CCT TAT TCA GCA TTT C-3′),Smo(上游5′-CTG GTG TGG TTT GGT TTG TG-3′，下游 5′-CAG GTG GAA GTA GGA GGT CTT G-3′),Gli1(上游 5′-ATC CTT ACC TCC CAA CCT CTG T-3′，下游5′-CCA ACT TCT GGC TCT TCC TGT A-3′),GAPDH(上游 5′-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3′，下游 5′-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3′)由上海生工生物工程股份有限公司合成。反转录条件：37℃、15 min，85℃、15 s。RT-PCR反应条件：预变性95℃，10 s；循环95℃、5 s，60℃、34 s，扩增40个循环。收集荧光信号在60℃、34 s反应阶段中，使用iQTM5软件分析PCR过程各检测样本的Ct值，计算目的基因相对于内参基因GAPDH的相对表达量(2-△△Ct法)，结果越大则目的基因的表达越强。

2 结 果

2.1 辛伐他汀对人BxPC-3细胞株生长曲线的影响 与对照组比较，5-FU组，辛伐他汀高、中剂量组第4、5、6、7天BxPC-3细胞株活细胞计数明显减少(P<0.05)；与5-FU组比较，辛伐他汀低剂量组第4、5、6、7天BxPC-3细胞株活细胞计数明显增加(P<0.05)。见表1。

与对照组比较：1)P<0.05；与5-FU组比较：2)P<0.05；下表同

2.2 辛伐他汀对人BxPC-3细胞株增殖抑制率的影响 与对照组比较，5-FU组，辛伐他汀高、中剂量组人BxPC-3细胞株OD值明显降低(P<0.05)；与5-FU组比较，辛伐他汀低剂量组BxPC-3细胞株OD值明显增加(P<0.05)。见表2。

2.3 辛伐他汀对人BxPC-3细胞株运动能力的影响 与对照组比较，5-FU组，辛伐他汀高、中剂量组BxPC-3细胞株48 h划痕距离明显增加(P<0.05)，愈合百分比明显降低(P<0.05)；与5-FU组比较，辛伐他汀低剂量组BxPC-3细胞株48 h划痕距离明显降低(P<0.05)，愈合百分比明显增加(P<0.05)。见表3。

2.4 辛伐他汀对人BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表达的影响 与对照组比较，5-FU组，辛伐他汀高、中剂量组人BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表达均明显降低(P<0.05)；与5-FU组比较，辛伐他汀低剂量组BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白及mRNA表达均明显增加(P<0.05)。见表4。

表2 辛伐他汀对人BxPC-3细胞株增殖抑制率的影响

表3 辛伐他汀对人BxPC-3细胞株运动能力的影响

表4 辛伐他汀对BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白(OD值)及mRNA表达量(2-△△Ct)的影响

3 讨 论

PC的发病机制较复杂，PC与Raf〔13〕、Wnt、Hedgehog信号通路等密切相关，其中Hedgehog信号通路逐渐成为目前的研究热点。在英文中Hedgehog是刺猬的含义，其相关的通路基因称为刺猬基因。Hedgehog信号通路高度保守，参与机体组织器官的发育。在正常人群的成熟细胞中，Hedgehog信号通路表达水平较低，而在恶性肿瘤中如PC则会出现高表达，促进PC细胞增殖。

Hedgehog信号通路的基本构成包括配体蛋白Hh蛋白、膜受体蛋白Ptch和Smo、核转录因子Gli、Hh蛋白信号复合体(HSC)等。Hh蛋白主要分为Shh、Ihh、Dhh几种类型，Shh蛋白是Hedgehog信号通路的研究热点。Ptch蛋白主要分为Ptch1、Ptch2两种类型，Ptch1可以与Hh蛋白结合而调控Hedgehog信号通路的信息传递，Ptch1还可以调控下游的信号分子Smo的表达，倘若Ptch1表达上调，就会激活下游信号Smo蛋白，从而活化Hedgehog信号通路，进而诱发肿瘤。核转录因子Gli蛋白主要分为Gli1、Gli2、Gli3几种类型，其中Gli1蛋白表达于细胞质和细胞核内，Gli1可以将Hedgehog信号通路中Shh、Ptch1、Smo的信号信息传递到肿瘤细胞的细胞核内，启动相关靶基因(GAC CAC CCA)的转录和翻译，例如Gli可以作用于B细胞淋巴瘤/白血病因子(Bcl)-2，促使肿瘤细胞免于细胞凋亡，调节细胞周期相关蛋白表达而促进肿瘤细胞增殖。经过以上的分析，可见Hedgehog信号通路的关键蛋白Shh、Ptch1、Smo、Gli1的表达与PC密切相关。

辛伐他汀对人BxPC-3细胞株的药理作用存在剂量-效应关系，而辛伐他汀高、中剂量对人BxPC-3细胞株生长具有抑制作用，与5-FU 对人BxPC-3细胞株的抑制作用等效，而辛伐他汀低剂量治疗PC的效果较差。

辛伐他汀可以抑制人BxPC-3细胞株增殖，而低剂量对人BxPC-3细胞株的抑制作用较差。预示随着辛伐他汀剂量的增加，辛伐他汀对人BxPC-3细胞株增殖抑制能力逐渐增强，提示辛伐他汀抗PC存在剂量-效应关系。

5-FU和辛伐他汀高、中剂量对人BxPC-3细胞株运动能力具有很强的抑制作用，随着剂量的增加，辛伐他汀对人BxPC-3细胞株运动能力的影响就会更加明显；而辛伐他汀低剂量对人BxPC-3细胞株的运动能力影响较差，以上显示，开展辛伐他汀抗PC的研究需要选择辛伐他汀高、中剂量(20、10 μmol/L)。

辛伐他汀不同剂量可以减弱Hedgehog信号通路活化水平，减少配体蛋白Shh的表达，降低膜受体蛋白Ptch1、Smo的表达，同时还降低核转录因子Gli1的表达，进而减少靶基因序列(GAC CAC CCA)的转录和翻译，减少下游相关的信号如Bcl-2表达，促进细胞周期阻滞，从而抑制人BxPC-3细胞株增殖和生长。而辛伐他汀低剂量对Hedgehog信号通路活化水平影响较差。本实验中人BxPC-3细胞株Shh、Ptch1、Smo、Gli1表达下调的同时伴有人BxPC-3细胞株生长增殖水平和运动水平受到抑制，推测辛伐他汀抑制PC生长增殖、运动等生物学活性是通过抑制Hedgehog信号通路Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白和基因表达来实现的。

综上所述，辛伐他汀可以通过降低Hedgehog信号通路相关蛋白和基因表达体现对BxPC-3的抑制作用，预示Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白或将是治疗PC的靶点蛋白。

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〔2016-09-16修回〕

(编辑 袁左鸣)

Effects of simvastatin on Shh associated protein of BxPC-3 cell line in the pancreatic cancer

FEI Hong-Xin，ZHANG Xiao-Jie，ZHANG Ying-Bo.

Qiqihar Medical College，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

Objective To study the effects of simvastatin on Shh associated protein of BxPC-3 cell line in the pancreatic cancer.Methods BxPC-3 cell line of pancreatic cancer were randomly divided into control, 5-Fluorouracil(5-FU,50 μmol/L), simvastatin high-(20 μmol/L)，middle-(10μmol/L)， low-dose (5 μmol/L) groups. The trypan blue staining and MTT were used to determine growth curve of BxPC-3 cell line and OD values of pancreatic cancer. The cell scratch was used to determine the exercise capacity of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer. Immunohistochemistry (IHC) and real-time PCR (RT-PCR) was applied for detecting Shh，Ptch1，Smo，Gli1 levels in BxPC-3 cell line of pancreatic cancer.Results Compared with the control group, OD values of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer, exercise capacity，Shh, Ptch1, Smo, Gli1 level were significantly decreased in 5-FU, simvastatin high-dose and middle-dose groups(allP<0.05).Conclusions Simvastatin plays a certain role in the treatment of BxPC-3 cell line of pancreatic cancer by inhibiting Shh, Ptch1, Smo, Gli1.

Simvastatin；Pancreatic cancer；BxPC-3 cell line

国家自然科学基金 (81173576，81373777，81173599)；黑龙江省自然科学基金(H201354)；黑龙江省教育厅资金(12521624，12531788，12531790)；齐齐哈尔医学院院内科研博士专项基金项目(QY2016B-21)

张英博(1973-)，男，博士，副主任医师，主要从事肿瘤、肝纤维化、痴呆研究。

费洪新(1978-)，男，博士，讲师，主要从事肿瘤、抑郁症、痴呆、痛风研究。

R285

A

1005-9202(2017)09-2081-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.001