结直肠癌与溶质载体家族第5家族8基因甲基化相关性研究

李楠，王强，矫政洧，靳小石，程树杰

（河北大学附属医院基本外科，河北保定071000）

结直肠癌与溶质载体家族第5家族8基因甲基化相关性研究

李楠，王强，矫政洧，靳小石，程树杰

（河北大学附属医院基本外科，河北保定071000）

目的研究结直肠癌组织中溶质载体家族第5家族8（SLC5A8）基因甲基化现象。方法采集结直肠癌患者标本中的癌组织、癌旁组织和正常组织，应用甲基化特异性聚合酶链式反应（PCR）法检测SLC5A8基因甲基化水平。结果结直肠癌组织、癌旁组织及正常组织中SLC5A8基因甲基化率，差异有统计学意义（P＜0.05），其中结直肠癌组织中SLC5A8基因甲基化阳性率与癌旁组织及正常组织之间差异有统计学意义（P＜0.05）。SLC5A8的表达与其甲基化状态成负相关（r=-0.682）。结论SLC5A8基因的甲基化是结直肠癌发生过程中的重要事件，与其发生、发展可能存在密切关联。

结直肠癌；溶质载体家族第5家族8；基因甲基化

结直肠癌（carcinoma of large intestine）是目前发病率死亡率均居高不下的一种消化道恶性肿瘤，其发生过程有多因素、多基因和多步骤共同参与。随着研究的深入，发现在肿瘤的发生过程中存在许多抑癌基因的甲基化，从而抑制抑癌基因的表达，导致肿瘤的发生。溶质载体家族第5家族8基因（solute carrier 5A8，SLC5A8）是新近发现的抑癌基因，由于该基因在正常结肠组织中大量表达，因而本研究拟对结直肠癌组织中SLC5A8进行研究，期待发现新的线索。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年6月-2016年12月在河北大学附属医院普外科住院手术结直肠癌患者40例。其中，直肠癌患者为21例，结肠癌患者为19例；男22例，女18例；年龄52～80岁，平均60.5岁。采集其结直肠癌组织、癌旁组织（距离肿瘤边缘0.5 cm）及正常组织（距离肿瘤边缘≥5 cm），液氮中贮存备用。所有患者术前均未行任何放化疗治疗及免疫治疗。

1.2 试剂和仪器

1.3 引物的设计和合成

SLC5A8基因引物应用引物设计软件Primer 5，参照Gene Bank自行设计，所有引物均由上海英潍捷贸易有限公司合成。引物序列（见表1）。

表1 引物序列与扩增片段

1.4 实验方法

将提取出来的DNA按Epi Tect Fast DNA Kit（德国Epi Tect公司）试剂盒说明书将脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）进行亚硫酸氢盐修饰，用Epi TectMSP（德国EpiTect公司）试剂盒进行甲基化特异性PCR。扩增完成后，取扩增产物进行电泳。将琼脂糖凝胶板放入全自动凝胶成像仪中，在紫外光下显影，拍照保存，并记录实验结果。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0统计软件，计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织中SLC5A8基因甲基化与临床特征的关系

结果显示，SLC5A8基因的甲基化与结直肠癌患者的性别、年龄、部位及临床分期无相关性（见表2）。

表2 结直肠癌不同临床特征SLC5A8基因甲基化率的比较

2.2 SLC5A8基因甲基化阳性率情况

SLC5A8基因甲基化PCR结果显示，癌组织标本有72.5%（29/40）显示出甲基化扩增产物条带；癌旁组织中为10%（4/40）；正常结直肠组织中为5%（2/ 40）。三者差异有统计学意义（χ2=34.680，P＜0.05），见附图。

2.3 结直肠癌组织中SLC5A8基因甲基化与SLC5A8基因表达率的关系

附图SLC5A8基因甲基化PC R扩增产物电泳图

在40例结直肠癌组织中有29例发生SLC5A8基因甲基化，在29例阳性标本中有28例（96.55%）未检测到SLC5A8表达。11例SLC5A8甲基化阴性的标本中检测到10例（90.91%）有表达，两者差异有统计学意义（χ2=26.368，P=0.000）。SLC5A8的表达与其甲基化状态呈负相关（r=-0.682，P=0.000）。

3 讨论

SLC5A8作为新的候选抑癌基因，其编码的蛋白是与钠离子偶联的转运短链脂肪酸、乳酸、烟酸和碘化物的细胞膜载体，属于钠离子/葡萄糖共转运蛋白家族成员[1]。SLC5A8在多种组织中表达，并在多种肿瘤中表达沉默，例如胃癌、甲状腺肿瘤、锯齿状腺瘤、贲门癌、肺癌、胰腺癌、食管癌和脑胶质瘤等[2-9]，其在结直肠上皮细胞的顶膜上表达。通过SLC5A8转运体有效的转运辅助，短链脂肪酸在结直肠浆膜面的上皮细胞层都可达到很高的浓度。对保护结直肠上皮细胞免于炎症及癌症的侵害作用上至关重要。研究证实，SLC5A8编码蛋白转运底物主要是酮体，而该过程是与钠偶联并生电。并推测SLC5A8在该细胞的能量代谢过程中起到至关重要的作用[10-11]。由此可见，SLC5A8转运体是保证人体细胞正常代谢的必要保证，如果表达缺失，可能导致正常细胞生理功能失常；在致癌微环境下，可能进一步导致细胞癌变。

SLC5A8基因在人体内广泛表达，并在分子水平上对正常细胞起到保护作用。该基因的沉默，导致细胞在致癌微环境中丧失一定的自我保护及修复能力，增加细胞癌变几率，并在癌细胞增殖过程中对肿瘤细胞起到一定的保护作用，因此在肿瘤的发生、发展过程中SLC5A8基因的沉默起到至关重要的作用。肿瘤细胞选择性的沉默该基因是维持其持续的增殖状态，并逃避凋亡最终结局的重要机制。既往研究证实，SLC5A8基因在多种肿瘤组织中被沉默，其机制主要是其外显子1中的GpG岛广泛的甲基化[12]。所以SLC5A8基因的检测手段可作为早期诊断及预后评估的重要检测指标。

结果显示，癌组织有72.5%（29/40）甲基化阳性，高于癌旁及正常组织，差异有统计学意义（χ2= 34.680，P＜0.05）。而且SLC5A8基因的甲基化与肿瘤患者的年龄、性别、位置及临床分期无关，这与PARK JY等人的研究结果相一致[5]。表明SLC5A8基因的甲基化与结直肠癌的发生相关，SLC5A8基因的甲基化可能是结直肠癌发生的重要影响因素，并可能是该基因表达沉默的主要机制。然而SLC5A8基因在肿瘤组织中并不是100%出现甲基化，这说明SLC5A8基因的甲基化并不只通过表观遗传学的甲基化被抑制表达，可能也存在经典遗传学途径抑制SLC5A8基因的表达；另外也说明SLC5A8及基因的甲基化只是在结直肠癌的发生过程中的原因之一，在这个过程中同时存在经典遗传学、表观遗传学以及环境等多方面的因素。

在40例结直肠癌组织中有29例发生SLC5A8基因甲基化，在这29例阳性标本中有28例（96.55%）未检测到SLC5A8表达，11例SLC5A8甲基化阴性的标本中检测到10例（90.91%）有表达，结直肠癌组织中SLC5A8基因甲基化阳性的表达率低于甲基化阴性的结直肠癌组织（χ2=26.130，P＜0.05）。SLC5A8的表达与其甲基化状态成负相关（r= -0.682），这说明SLC5A8基因的甲基化是该基因表达沉默的主要机制。该现象表明，SLC5A8基因的甲基化是结直肠癌发生过程中的早期事件，可能贯穿于结直肠癌发生过程的始末，并可能是结直肠癌标志性的基因改变。这使得进一步研究SLC5A8基因甲基化的转复能否抑制结直肠癌细胞生长及SLC5A8基因甲基化与结直肠癌患者预后的研究奠定了基础。使今后临床检测SLC5A8基因的甲基化状态对肿瘤的早期诊断、治疗及预后成为可能。

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Correlation of colorectal cancer andSLC5A8gene methylation

Nan Li,Qiang Wang,Zheng-wei Jiao,Xiao-shi Jin,Shu-jie Cheng
(Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Hebei University, Baoding,Hebei 071000,China)

ObjectiveTo study the methylation ofSLC5A8gene in colorectal cancer.MethodsSpecimens adjacent to carcinoma tissue and normal tissue in the patients with colorectal cancer tissue were collected. Methylation specific polymerase chain reaction(PCR)method was used to detectSLC5A8gene methylation level.ResultsDifferences in colorectal cancer tissue,the tissue adjacent to carcinoma and normal tissues of SLC5A8gene methylation rate were statistically significant(P＜0.05).Differences ofSLC5A8gene methylation positive rate in colorectal cancer tissues,cancer adjacent tissues and normal tissues was statistically significant (P＜0.05).TheSLC5A8gene expression and methylation status is negative correlation(r=-0.682).ConclusionsTheSLC5A8gene methylation is important in the process of colorectal cancer occurs,it may have closely relationship of occurrence and development.

colorectal cancer;SLC5A8;gene methylation

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.08.009

1005-8982（2017）08-0043-04

2016-09-20

靳小石，E-mail：doctorjinxiaoshi@126.com