聚乳酸-聚己内酯/丝素蛋白三元复合纳米纤维膜支架的结构与性能

王利君， 熊 杰， 骆菁菁,3， 赵兴艳， 赵新飞(. 浙江理工大学 材料与纺织学院， 浙江 杭州 3008； 2. 浙江理工大学 服装学院， 浙江 杭州 3008；3. 浙江理工大学 生命科学学院， 浙江 杭州 3008 )

聚乳酸-聚己内酯/丝素蛋白三元复合纳米纤维膜支架的结构与性能

王利君1,2， 熊 杰1， 骆菁菁1,3， 赵兴艳1， 赵新飞1
(1. 浙江理工大学 材料与纺织学院， 浙江 杭州 310018； 2. 浙江理工大学 服装学院， 浙江 杭州 310018；3. 浙江理工大学 生命科学学院， 浙江 杭州 310018 )

通过静电纺丝技术制备出不同质量比的聚乳酸-聚己内酯/丝素蛋白(PLA-PCL/SF)复合纳米纤维膜支架，采用扫描电子显微镜、傅里叶红外光谱仪对纳米纤维膜的形貌和结构进行表征，测试纤维膜的孔隙率和吸附性能。结果表明：PLA-PCL与SF这2种组分的质量比对复合纳米纤维膜的形貌有显著影响，质量比为90∶10和70∶30的纳米纤维表面分布着密集的孔洞；PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜中SF经甲醇处理后由无定形结构转变为β-折叠结构；随着复合纳米纤维膜中SF含量的增加，纳米纤维膜的孔隙率和吸附性也逐渐降低。接触角实验和小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)培养结果表明，SF的加入提高了纳米纤维膜的亲水性，有利于NIH-3T3细胞的黏附和增殖。

聚乳酸； 聚己内酯； 丝素蛋白； 静电纺丝； 纳米纤维膜支架； 生物相容性

biocompatibility

组织工程通过整合生物支架材料、活体细胞和生物活性因子以实现修复和改善组织损伤的目的。其中组织工程支架作为修复过程中力学支撑的同时，为细胞提供增殖、黏附和迁移所需的微环境。众多支架材料中，由于纳米纤维支架能很好地模拟人体天然细胞外基质(ECM)的结构和功能而受到广泛关注[1]。而静电纺丝法被认为是现阶段制备纳米纤维最简单有效的技术之一，其具有比表面积高，孔隙率高，网络结构相互贯通等优点，广泛应用于组织工程领域[2]。

体外设计和构建纳米纤维支架应具有生物相容性、力学稳定性及可降解性。作为常用的高分子合成材料，聚乳酸(PLA)和聚己内酯(PCL)可在体内降解为无毒物质[3]。在性质上，玻璃态的PLA具有良好的拉伸强度和生物降解速率，但其柔韧性差，橡胶态的PCL虽然柔韧性大，生物相容性强，但生物降解速率缓慢[4-5]，这限制了二者在很多领域的应用。因此，将具有良好生物相容性的PLA和PCL材料共混，可实现二者优势的互补，得到力学性能较好的复合材料[6]。前期研究[7]通过静电纺丝方法获得了具有表面沟壑结构的PLA-PCL复合纳米纤维，但由于PLA-PCL复合材料制备出的纳米纤维膜亲水性差，生物活性低，与天然的生物材料或人体组织相比，不利于细胞的黏附与增殖[8]，故常与细胞相容性强的天然材料进行共混改性。丝素蛋白(SF)是具有良好的生物可降解性和相容性的天然蛋白质，对水和氧通透性好，植入人体后无免疫原性，在临床上用作医用缝合线已有多年[9]，将其与合成材料复合，将有助于改善纳米纤维膜的亲水性，提高复合纳米纤维膜的生物活性。然而现有研究主要集中在PLA-PCL复合纳米纤维膜[2-6]、PLA或PCL与天然生物材料共混的静电纺丝纤维膜[9]在组织工程中的应用，丝素蛋白对PLA-PCL复合纳米纤维的形貌、结构和性能的影响鲜有报道，因此，本文采用静电纺丝法制备不同质量比的PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜材料，分析不同质量比的纳米纤维膜的形貌和结构，测试材料的孔隙率、吸附性以及亲水性，并研究了不同质量比的纳米纤维膜对小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)生长的影响。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

家蚕生丝(浙江桐庐)；聚乳酸(PLA，质均分子质量为100 000)、聚己内酯(PCL，质均分子质量为80 000)、噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；六氟异丙醇(HFIP，盐城冬阳生物制品有限公司)；甲醇、乙醇(杭州高晶精细化工有限公司)；碳酸钠、氯化钙(国药集团)；透析袋(截留分子质量为14 ku，美国联合碳化物公司)；高糖DMEM培养基(赛默飞世尔有限公司)；青霉素钠100 U/mL(上海碧云天生物技术有限公司)；硫酸链霉素100 U/mL(上海碧云天生物技术有限公司)；胎牛血清(FBS，Biowest公司)；磷酸盐缓冲液(PBS，Amrcsco公司)；小鼠胚胎成纤维细胞NIH-3T3(实验室保存)。

KDS220型微量注射泵(KD Scientific)；FC60P2型高压电源(Glassman公司)；FreeZone型冷冻干燥机(LABCONCO公司)；恒温磁力搅拌器(C-MAG HS7digital IKANAG®，IKA公司)。

1.2 PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜的制备

前期研究结果表明，当PLA与PCL质量比为80∶20时，通过静电纺丝可获得具有表面沟壑结构的纳米纤维[7]。在此基础上，为考察SF加入量对三元体系纤维形貌的影响，将PLA-PCL与SF以质量比为100∶0、90∶10、70∶30、50∶50、30∶70、0∶100溶解于HFIP中，制得质量分数为8%的PLA-PCL/SF纺丝液。将纺丝液倒入直径为16 cm的注射器中，以铝箔为接收装置，在溶液流速为0.6 mL/h，纺丝电压为12 kV，接收距离为13 cm的条件下进行静电纺丝。将制备好的纳米纤维膜放入真空干燥箱中干燥24 h后，浸入体积比为90∶10的甲醇和水混合溶液中浸泡10 min，晾干备用。

1.3 复合纳米纤维膜的结构表征

采用Vatrass扫描电子显微镜(FE-SEM)观察甲醇处理前后纳米纤维的形貌；采用Nicolet5700傅里叶红外变换光谱仪(FT-IR)检测甲醇处理前后纤维膜化学结构的变化，采用溴化钾压片，波数范围为4 000～400 cm-1。

1.4 复合纳米纤维膜的性能测试

1.4.1 接触角测试

用DCA-322动态接触角分析仪测试纳米纤维膜的表面亲水性能，将样品固定于载玻片上保持平整，滴加蒸馏水2 μL，每个样品取5个平行样。

1.4.2 孔隙率测试

通过排乙醇溶液的方法测定纳米纤维膜的孔隙率。称得纤维膜样品质量为ms，装满乙醇后比重瓶质量为m1，将纤维膜浸入至比重瓶后真空排气，使纤维膜与乙醇充分接触，向比重瓶中加满乙醇称得其质量为m2，用镊子取出充分浸润的样品，称得剩余乙醇和瓶子质量为m3[10]，按照下式计算纳米纤维膜的孔隙率：

1.4.3 吸附率测试

采用羟基磷灰石吸附法评价纳米纤维膜的吸附能力。将纳米纤维膜(质量为mb)置于0.5%纳米羟基磷灰石水溶液中，于30 ℃转速为120 r/min匀速摇床上孵育24 h，取出吸附羟基磷灰石的纳米纤维膜，称得质量为ma，按照下式计算纳米羟基磷灰石在纳米纤维膜表面的吸附量：

1.4.4 力学性能测试

将纳米纤维膜裁剪成尺寸为50 mm × 5 mm的样条，通过KEG-G1型多功能拉伸仪测试其拉伸曲线，夹头间距为20 mm，以2 mm/s的加载速度对样品进行拉伸测定，每组平行测试2个样条。

1.4.5 细胞增殖测试(MTT法)

将各组纤维膜裁剪成直径为6 mm的圆片置于96孔板中，用75%的乙醇消毒4 h，用无菌PBS溶液漂洗3次，用DMEM培养液浸泡试样过夜。将胰酶消化后的NIH-3T3细胞以5×104个/mL的密度接种于纤维膜上，每孔加入100 μL细胞悬浮液，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。分别在接种后的第1、4、7天取出96孔板，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，于细胞培养箱中继续培养4 h后，小心吸弃培养液，加入150 μL的DMSO，振荡10 min使紫色结晶物甲瓒完全溶解，吸取100 μL至新96孔板中，在酶标仪上读取490 nm波长处吸光值。

2 结果与讨论

2.1 质量比对复合纳米纤维膜形貌的影响

PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜甲醇处理前后的FE-SEM照片分别如图1、2所示。

图1 不同质量比PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜甲醇处理前的FE-SEM照片Fig.1 FE-SEM images of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite fibrous membranes before methanol treatment

图2 不同质量比PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜甲醇处理后的FE-SEM照片Fig.2 FE-SEM images of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite fibrous membranes treated by methanol

从图1、2中观察到，PLA/PCL纳米纤维表面分布着沟壑，其形成机制是溶液从喷头被挤出后，溶剂迅速从射流中挥发，在射流表面形成孔洞，射流被高压电场拉伸，孔洞逐渐被拉伸成沟壑，当纤维沉积在接受板上，孔洞以沟壑的状态呈现在纤维表面[9]。随着SF含量的增加，纤维表面形貌发生了改变，由PLA/PCL纳米纤维表面沟壑状形貌转变为PLA-PCL/SF复合纳米纤维表面孔洞状结构。当SF含量增加到50%以上时，纤维表面光滑。SF的加入对复合纳米纤维表面形貌的改变主要由于低含量的SF在甲醇处理后转变为β折叠结构，分散于PLA-PCL相中进而形成表面孔洞形貌的纤维[10]。而在高含量SF的PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜中，纤维表面主要受丝素蛋白的主导作用而趋于光滑。

2.2 复合纳米纤维膜化学结构分析

注：a—甲醇处理前(0∶100);b—甲醇处理后(0∶100)；c—甲醇处理前(50∶50);d—甲醇处理后(50∶50);e—甲醇处理前(100∶0)。图3 PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜甲醇处理前后FT-IR图谱Fig.3 FT-IR images of PLA-PCL /SF composite fibrous membranes before and after methanol treatment

2.3 接触角分析

材料的亲水性对细胞黏附增殖等行为具有较大影响，而接触角是亲水性能的重要指标之一。为此，考察了不同含量SF的加入对材料表面接触角的影响，结果如图4所示。由图可知：PLA-PCL纳米纤维膜呈疏水性，接触角为134.66°；随着SF含量的增加，复合纳米纤维膜的接触角不断减小，表明亲水性不断增加。

图4 PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜的水接触角Fig.4 Water contact angle images of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous members

2.4 纤维膜对纳米羟基磷灰石的吸附性能

表1示出甲醇处理后不同质量比PLA-PCL/SF纤维膜的孔隙率。可见，随着SF含量的增加，纤维膜孔隙率降低。这是由于甲醇处理使SF由无定型结构转变为β折叠结构，纤维膜发生收缩，孔隙率减小。

表1 PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜的水接触角、孔隙率和吸附率Tab.1 Water contact angle, porosity and adsorptivity of PLA-PCL/SF composite nanofibrous membranes

通过羟基磷灰石吸附法测定不同纳米纤维膜对纳米羟基磷灰石的吸附能力，纤维膜的孔隙率与其对羟基磷灰石的吸附率呈正相关，随着孔隙率减少，吸附性也下降。PLA-PCL与SF质量比为90∶10和70∶30时，复合纳米纤维膜的吸附率较大，不仅由于纤维表面的孔洞结构进一步增加了纤维表面的比表面积，从而提高了纤维膜的吸附性，而且纤维膜的孔隙率较大时，有利于纤维膜对纳米羟基磷灰石的吸附。

2.5 力学性能分析

表2示出不同丝素含量复合纤维膜的拉伸力学性能。从表可见，PLA-PCL纤维膜的弹性模量、平均断裂强度和断裂伸长率均高于PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜。且随着SF含量的增加，复合纤维膜的拉伸强度和断裂伸长率均逐渐减小。这是由于天然SF是脆性材料，相对于纯丝素膜，PLA-PCL有效提高了复合纤维膜的拉伸性能(见图5)。

表2 不同质量比PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜的力学性能Tab.2 Mechanical properties of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous membranes

图5 不同质量比的PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜的应力-应变曲线图Fig.5 Stress-strain curves of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous members

2.6 细胞增殖性能分析

细胞在支架材料上生长、黏附和增殖情况是评价纤维膜生物相容性的重要指标。利用MTT法，检测活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的活力，其总活性与细胞数呈正相关，可间接反映细胞数目及细胞增殖能力。图6示出不同质量比PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜上NIH-3T3细胞的活性。可以看出，随着SF含量的增加，细胞活性呈明显增加趋势，表明PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜具有良好的生物相容性，SF的加入有利于NIH-3T3细胞的生长与增殖。从细胞电镜照片(见图7)可看出，支架表面细胞培养7 d后，细胞呈铺展的形态，且随着SF含量的增加，细胞铺满支架表面，该现象与MTT结果一致，表明SF的加入可改善材料的生物相容性。

图6 不同质量比PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜上NIH-3T3细胞的活性Fig.6 NIH-3T3 cell activities of different mass ratios of PLA-PCL/SF composite nanofibrous membranes

图7 NIH-3T3细胞在不同质量比PLA-PCL/SF复合纤维膜上培养7 d的FE-SEM照片Fig.7 FE-SEM images of NIH-3T3 cells on different mass ratios of PLA-PCL/SF composite membranes after 7 d

3 结 论

通过静电纺丝法制备的复合纳米纤维膜经醇处理后，丝素蛋白相由无规自由态转变为β折叠结构，质量比为90∶10和70∶30的PLA-PCL/SF纳米纤维表面分布密集的孔洞，且纤维表面的孔洞随着SF含量的增加而减少。通过调节PLA-PCL和SF的质量比可调控纤维的表面形貌。随着复合纳米纤维膜中SF含量的增加，纤维膜的孔隙率和吸附率逐渐降低，但亲水性却逐渐改善。NIH-3T3细胞能在PLA-PCL/SF复合纳米纤维膜上很好地生长，且丝素蛋白含量越大，细胞增殖越好，与纤维膜的孔隙率和吸附率相比，纤维膜亲水性对细胞相容性影响更大。

FZXB

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Structure and properties of polylactic acid-polycaprolactone/silk fibroin composite nanofibrous scaffolds

WANG Lijun1,2， XIONG Jie1, LUO Jingjing1,3, ZHAO Xingyan1, ZHAO Xinfei1
(1.CollegeofMaterialsandTextiles，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou，Zhejiang310018，China； 2.SchoolofFashionDesign，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou，Zhejiang310018，China； 3.CollegeofLifeSciences，ZhejiangSci-TechUniversity，Hangzhou，Zhejiang310018，China)

Polylactic acid-polycaprolactone/silk fibroin (PLA-PCL/SF) composite nanofibrous scaffolds with different mass ratios were fabricated by electrospinning. The morphologies and structures of nanofibrous mats were characterized by scanning electron microscopy (SEM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). The porosity and adsorbent behavior of the fibrous mats were also measured. The results shows that the mass ratio of PLA-PCL and SF components has obvious influence on the morphologies of nanofibrous scaffolds, and high density pores present on nanofibrous surfaces at mass ratios of 90∶10 and 70∶30. The structure of SF in PLA-PCL/SF composite scaffold is changed from amorphous structure to β-sheet conformation by methanol treatment. The porosity and adsorbent behavior of the nanofibrous mats decrease with increasing SF contents in composite nanofibrous scaffolds. The water contact angle test and mouse fibroblasts cells (NIH-3T3) culture results indicate that the hydrophilicity of nanofibrous scaffolds is improved by the addition of SF for better adhesion and proliferation of NIH-3T3 cells.

polylactic acid; polycaprolactone; silk fibroin; electrospinning; nanofibrous scaffold;

2016-04-27

2017-01-26

国家自然科学基金项目(11272289)

王利君(1971—)，女，博士生。主要研究方向为复合纳米纤维材料。熊杰，通信作者，E-mail: jxiong@zstu.edu.cn。

10.13475/j.fzxb.20160407606

TQ 342.87

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