酶解低温提取灵芝水提取物过程研究

翟 威 宋伟杰 王 强 吴媛媛 罗建泉 王星丽 瞿 亮 万印华

（1中国科学院过程工程研究所，北京100190；2杭州百山祖生物科技有限公司，杭州310052）

灵芝（Ganoderma lucidum）又称林中灵、琼珍，原产地为中国，在我国已有上千年的药用历史。灵芝中提取的灵芝多糖具有调节免疫系统、保肝、抗肿瘤、抗衰老、提高机体的耐缺氧能力等药用价值[1～2]。现在工业上获取灵芝多糖一般采用传统的水提醇沉法[3]，水提醇沉法中初步获得灵芝水提物的热水浸提法具有操作温度高，能源消耗大的缺点，而且高温操作存在破坏多糖结构的可能性，所以其它的提取方式逐渐成为灵芝多糖的研究热点。周吴萍等[4]采用回流提取法将灵芝多糖的得率提高到1.75%，但是仍未规避高温提取。郑静[5]等采用超声波与纤维素酶结合的方法可将灵芝水提物中灵芝多糖含量提升到57.62%，但超声波存在破坏多糖结构的缺点。试验采用酶解法完全取代热水提取法，使提取过程在低温下进行，并将低温提取过程与高温提取过程进行对比，采用单因素试验与正交试验结合的方法，确定灵芝酶解的最佳条件，为下一步酶解低温提取灵芝多糖方法在工业上的应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试验试剂 灵芝干燥实体，由杭州百山祖生物科技有限公司提供；木瓜蛋白酶（800 000 U/g）、纤维素酶（10 000 U/g）、果胶酶（30 000 U/g），由南宁庞博生物工程有限公司生产；苯酚，分析纯，由国药集团化学试剂有限公司生产；葡萄糖，分析纯，由西陇化工股份有限公司生产；硫酸，分析纯，由北京化工厂生产；盐酸，分析纯，由北京化工厂生产；氢氧化钠，分析纯，由西陇化工股份有限公司生产。

1.1.2 主要试验仪器 FA2004电子天平，由上海舜宇恒平科学仪器有限公司生产；DGX-053B-1鼓风干燥箱，由上海福玛实验设备有限公司生产；DC-I-15台式封闭电炉，由天津市泰斯特仪器有限公司生产；HYG-A全温摇瓶柜，由苏州培英实验设备有限公司生产；S210pH计，由梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司生产；UV-9000S紫外可见分光光度计，由上海元析仪器有限公司生产；JJ-1增力电动搅拌器，由金坛市医疗仪器厂生产。

1.2 方法

1.2.1 葡萄糖标准曲线的绘制 将葡萄糖置于鼓风干燥箱中于105℃下干燥2 h后取出置于干燥器中冷却至室温，精密称取100 mg葡萄糖，定容至100 mL，配制为1 mg/mL的葡萄糖标准液。精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8 mL葡萄糖标准液，分别置于10 mL具塞比色管中，加水定容为1 mL，加入质量分数为6%的新配置苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速加入5 mL浓硫酸，摇匀，室温避光静置30 min，以1 mL超纯水按照同样操作作为空白对照，于490 nm测定吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标（x/mg/mL），A490nm为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到回归方程y=10.57x-0.001，r=0.994。

1.2.2 热水提取法提取灵芝多糖 将灵芝子实体清洗烘干后粉碎，精密称取灵芝子实体粉末20 g，加入400 mL水，加热至沸腾，之后搅拌加热3 h，期间保持液面不变，过滤后收集滤渣同条件再提取一次。合并两次所得提取液，采用硫酸苯酚法测量所得灵芝水提物中灵芝多糖含量[6]。

1.2.3 酶法提取灵芝多糖[7-8]精确称取灵芝子实体粉末5 g，加入250 mL锥形瓶中，加入100 mL水，根据设定条件调节pH并加入酶。置于摇瓶柜中，在150 r/min条件下反应，反应结束后过滤收集提取液，并采用硫酸苯酚法测量所得灵芝水提物中灵芝多糖含量。如需二次提取，则过滤后收集滤渣同条件再提取一次，合并所得提取液，采用硫酸苯酚法测量所得灵芝水提物中多糖含量。

2 结果与分析

2.1 单一酶提取过程活性酶的加入可以有效地提高植物性天然产品的提取效果，其中作为活性酶的纤维素酶可将植物细胞壁的纤维素水解成水溶性糖，经纤维素酶处理后的植物细胞壁水解破裂，利于胞内活性成分化合物的溶出；果胶酶可以使细胞间的果胶质降解，把细胞从组织内分离出来；木瓜蛋白酶可以分解蛋白质，因此试验中选择了纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶三种酶作为考察对象。考虑提取次数是影响提取过程的重要因素，首先对单一酶的提取过程进行了考察，并与热水提取法进行对比。以料液比1∶20，加酶量0.6%，不调节pH（原始pH），反应温度50℃，摇瓶柜速度150 r/min，提取时间3 h为条件，分别进行木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶的酶解低温提取过程，提取次数分别为一次和两次，结果见图1。从图1中的一次提取过程的提取效果看出，三种酶辅助的一次提取效果远低于热水提取法，这说明当提取液中的多糖浓度达到一定浓度的时候，多糖从灵芝子实体中的扩散受到抑制，此时需要更换新鲜提取液才能得到较高的多糖得率，即提高提取次数。从图1中二次提取的效果看，采用二次酶解提取法可以使酶解提取的效果大大提高，提取效果接近热水提取法，这说明采用二次酶解提取过程有可能获得高于常规热水提取过程的收率，而且可以实现在全低温下提取。

2.2 复合酶提取过程为进一步提高酶解过程的效果，按照1∶1和1∶1∶1的比例，配制了木瓜蛋白酶+纤维素酶，纤维素酶+果胶酶，木瓜蛋白酶+果胶酶，木瓜蛋白酶+纤维素酶+果胶酶四种复合酶，根据单一酶的最适pH选定复合酶的提取pH（表1），使复合酶提取过程中各个酶均在最接近单一酶最优pH的条件下进行提取，其它试验条件同2.1，试验结果见图2。从图2中可以看出复合酶提取效果要优于单一酶提取过程，特别是3种酶组成的复合酶，提取效果已经优于热水提取法。

图1 热水浸提法与酶辅助提取的效果对比

图2 热水浸提法复合酶辅助提取效果对比

表1 不同复合酶的p H选择

图3 不同添加量的酶辅助提取效果对比

2.3 复合酶单因素考察实验在确定出最佳酶解用酶后，进行了复合酶加入量与复合酶配比的单因素考察试验，其它试验条件不变。复合酶加入量考察试验结果见图3。从图3中可以看出在复合酶加入量为0.8%时提取效果达到最大值，之后开始出现下降，所以复合酶加入量确定为0.8%。再考察复合酶的最佳酶配比。三种酶分别按照1∶1∶1，1∶1∶2，1∶2∶1，2∶1∶1，2∶2∶1，2∶1∶2，1∶2∶2（木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶）七种不同比例复合，进行复合酶提取，结果见图4。由图4可以看出配比为1∶2∶2的复合酶酶解提取效果最好，多糖得率达到了5.75 g/100 g。

图4 不同配比复合酶辅助提取效果对比

2.4 复合酶最佳酶解条件正交试验

根据单因素试验结果，在复合酶加入量0.8%的条件下，以试验温度，料液比，料液pH，反应时间为考察因素，每个因素设定3个水平，进行4因素3水平的正交试验（详见表2）[9～10]。通过方差分析法分析[11～12]表3结果可知，对提取效果影响程度的重要性依次为反应时间大于料液pH大于料液比大于反应温度，最佳酶解条件为反应温度45℃，料液比1∶30，料液pH4.5，反应时间3 h。在此条件下进行复合酶的重复验证性试验，结果见图5，试验结果表明复合酶酶解提取所获得的灵芝水提物中灵芝多糖的含量较热水提取法提升20%以上。

表2 正交实验表

表3 正交实验数据分析表

图5 重复性验证试验

3 结 论

通过单因素试验与正交试验可知，复合酶法提取灵芝多糖较热水法有操作温度低，提取效果好的优点，复合酶最佳酶配比为木瓜蛋白酶∶纤维素酶∶果胶酶=1∶2∶2，最佳复合酶加入量为0.8%，最佳酶解条件为pH 4.5，温度45℃，料液比1∶30，酶用量0.8%，酶解时间3 h，酶解次数2。对酶解效果影响程度从大到小依次为反应时间大于料液比大于温度等于料液pH。

复合酶酶解低温提取灵芝多糖，较热水提取法有着操作温度低，能源消耗少，提取效果好的优点，但因为酶制剂价格较高，且添加的是复合酶，所以在成本方面会有一定的提高，而且因为要对提取液中的酶进行灭活，增加了后续纯化步骤中除蛋白的工作量。

研究主要考察完全酶法辅助低温提取的可行性，在后续研究中将进一步研究酶制剂的回收，以期能减小酶制剂的消耗，有效降低生产成本。