紫菜中类菌孢素氨基酸纯化工艺的优化及其抗紫外辐射作用研究
2017-05-24张朝辉段筱杉李八方
应 锐, 张朝辉, 段筱杉, 赵 雪, 侯 虎, 李八方
紫菜中类菌孢素氨基酸纯化工艺的优化及其抗紫外辐射作用研究
应 锐, 张朝辉, 段筱杉, 赵 雪, 侯 虎, 李八方
(中国海洋大学食品科学与工程学院, 山东青岛 266023)
为了筛选纯化紫菜类菌孢素氨基酸(mycosporine-like amino acid, MAAs)的离子交换树脂, 优化纯化工艺, 并研究纯化后MAAs体外抗紫外辐射活性, 本研究通过静态动力学吸附及解析实验, 筛选纯化树脂; 结合动态动力学吸附及解析单因素实验建立响应面法对SA-2型阳离子树脂纯化MAAs的二次多项式模型, 对MAAs的纯化工艺进行优化; 通过建立大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的复合紫外线(UVA+UVB)损伤模型, 分析纯化后MAAs样品的体外抗辐射活性。结果表明: 静态动力学吸附及解析实验筛选出SA-2型阳离子树脂为纯化MAAs的最佳树脂, 吸附率和解析率分别为86.01%和56.63%; 吸附的最佳工艺条件为: 上样液质量浓度3 g/L、上样流速1 mL/min、上样液pH为6、洗脱液体积分数为3%、洗脱流速为1.5 mL/min、洗脱液pH为6; 在此条件下吸附率为79.21%, 洗脱率为64.02%; 纯化后的MAAs样品能有效抑制紫外辐射而造成的损伤, 将菌种失活速度分别降低了39.10%和40.58%, 表现出显著的抗紫外辐射活性。
坛紫菜; 类菌孢素氨基酸; SA-2树脂; 纯化; 响应面; 抗紫外辐射
类菌孢素氨基酸(Mycosporine-like amino acids, MAAs)是一类广泛存在于藻类、浮游植物及微生物中的多羟基酮类化合物, 这类物质以环己烯酮为基本骨架, 通过连接不同种类的氨基酸缩合而成。由于侧链上所连接的活性基团与共轭双键的作用, 使得类菌孢素氨基酸存在多种功能活性, 在320~360 nm波长处具有较强的紫外线吸收作用, 基于这类物质对保护生命材料具有潜在的应用价值, 近年来已引起人们的广泛关注[1-4]。目前, 针对于这类物质的研究重点多聚焦于环境条件如温度、光照、盐度对藻类诱导产生并积累MAAs化合物的影响[4]。许志恒等也先后就从紫菜、江蓠等天然海藻中提取的类菌孢素氨基酸化合物其结构组成及抗氧化活性进行研究[5-8]。
但是, 针对于海藻中提取的MAAs生物活性的研究大多存在样品纯化工艺复杂、纯度较低等一系列问题。为进一步探究MAAs这类天然活性物质的药效成分、作用机理并实现将其应用于制药及化妆品工业中, 类菌孢素氨基酸纯化技术的改进与优化已成为需解决的首要问题[8-9]。目前, 针对这类物质多采用层析(硅胶柱层析、凝胶柱层析、大孔树脂、离子交换树脂层析等)等方法对其进行纯化分离[10-11]。而大孔树脂、离子交换树脂由于具有吸附量大、吸附率强、解析率高、可重复利用等优点成为纯化使用的首选[11]。
本文在此基础上, 选取类菌孢素氨基酸含量较高的经济型海藻坛紫菜为原料, 提取其中的MAAs, 参考牛美英等提出的用阳离子交换树脂纯化类菌孢素氨基酸的方法[7, 9], 选取5种纯化效果较好的离子交换树脂, 通过对比其吸附率及解析率, 选择最佳纯化树脂, 并结合单因素实验结果分别对其吸附率、解析率建立Box-Behnken响应面模型, 通过对比模型中各因素间交互关系, 优化纯化工艺[12-13]。并探究纯化后的紫菜类菌孢素氨基酸抗紫外辐射活性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
坛紫菜()海南地区生产(购于青岛利群商厦); SA-2、001*7、201*7、D61、D152型离子交换树脂(上海江莱生物科技有限公司); 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌(取自中国海洋大学微生物实验室); 无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、氨水、Tris-HCl、氯化钠均为分析纯; 水为双蒸水。
1.2 仪器与设备
粉碎机(天津泰斯特有限公司); HH-S4型恒温水浴锅(欧莱博科技有限公司); 搅拌器; 2-16型低温高速离心机(Sigma); R1001型旋转蒸发器(郑州长城仪器有限公司); PHS-3S型pH计(雷磁-上海仪电科学仪器股份有限公司); UV-2802型紫外可见分光光度计(Unico); BT100-2J蠕动泵; Φ10 mm×20 cm玻璃层析柱(北京瑞达恒辉科技发展有限公司); SW-CJ-1FD型超净工作台(南京贝登生物有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 MAAs粗提液的制备
参考金宁宁等[6]的提取方法, 对紫菜中类菌孢素氨基酸(MAAs)进行提取, 操作流程如下: 烘干紫菜→粉碎研磨过筛→40℃乙醇提取2 h→超声波辅助提取20 min→离心→减压蒸馏→醇沉→冷冻稳定→冷冻离心→减压蒸馏→真空冷冻干燥→冻干粗品→样品复溶→MAAs粗提液。
1.3.2 标准曲线的绘制及粗提液质量浓度的选择
选取紫菜类菌孢素氨基酸主要组分Porphyra- 334作为标准品。Porphyra-334的摩尔吸光系数334= 4.23×104mol/(L·cm), 依据朗伯比尔定律[14],可计算得出标准溶液的浓度。应用HPLC法测定该组分在紫菜类菌孢素氨基酸中所占比例, 可计算求得类菌孢素氨基酸的浓度[5], 采用UV-HPLC拟合法, 绘制标准曲线[6-7]。得到曲线方程为:= 20.889+0.008 47 (2=0.997 98)。根据方程, 分别计算并配制不同质量浓度梯度的样品粗提液。
1.3.3 MAAs纯化树脂的筛选
参考牛美英等[9]对多酚类物质的纯化方法, 以静态动力学吸附实验为依据, 绘制动力学吸附及解析图, 并分别以不同型号的阳离子交换树脂对样品的吸附量、吸附率、解析量、解析率为指标, 筛选出效果最佳的树脂作为进一步纯化所使用的树脂。
1.3.4 纯化树脂的预处理
将筛选出的阳离子交换树脂加入约4倍体积的双蒸水浸泡24 h后, 洗涤处理。分别用1 mol/L的HCl动态洗涤2 h, 用双蒸水冲洗至中性; 再用1 mol/L的NaOH动态洗涤2 h, 用双蒸水冲洗至中性; 最后在使用树脂前用1 mol/L的HCl将阳离子交换树脂浸泡、动态洗涤2 h, 使树脂转为酸性。
1.3.5 阳离子交换树脂纯化MAAs样品的单因素实验
1.3.5.1 动态动力学吸附条件优化
1) 样品质量浓度对吸附效果的影响
分别配制0.5~5 g/L的MAAs样品粗提液, 保持上样液pH为6, 上样流速为1 mL/min。计算不同质量浓度下样品的吸附率。
2) 上样液流速的吸附效果影响
配制3 g/L的MAAs样品粗提液, 调节pH为6。分别以0.5 ~3 mL/min的上样流速上柱样品。实验过程中上样液每经过0.5倍树脂柱内装载体积(Bed Volume, BV)收集一次样品, 定量检测MAAs化合物含量, 从而计算吸附率。
3) 上样液pH对吸附率的影响
选取质量浓度为3 g/LMAAs粗提液, 分别调节上样液的pH值从3到8, 以流速为1 mL/min的流速上柱, 通过计算流出液的浓度和体积, 计算吸附率。
1.3.5.2 动态动力学解析条件优化
1) 洗脱液的质量浓度对洗脱效果的影响
参考金宁宁等的纯化方法[7], 选取NH3·H2O水溶液作为洗脱液, 分别配制体积分数为1%~5%的NH3·H2O水溶液, 在固定洗脱液pH为6, 洗脱流速为1 mL/min, 洗脱体积为6 BV的条件下解析MAAs样品, 计算不同体积分数下洗脱液对洗脱率的影响。
2) 洗脱流速对洗脱效果的影响
在固定洗脱液体积分数为3%、洗脱液pH为6、洗脱体积为6 BV的情况下, 分别将洗脱液以洗脱流速为0.5~3 mL/min上柱洗脱, 通过计算洗脱液的浓度, 计算洗脱率。
3) 洗脱液pH对洗脱效果的影响
固定洗脱液体积分数为3%的NH3·H2O水溶液作为洗脱液, 洗脱流速为1.5 mL/min, 洗脱体积为6 BV的情况下, 调节洗脱液pH为2~8上柱洗脱, 通过计算洗脱液的浓度和体积, 计算洗脱率。
1.3.5.3 响应面试验优化MAAs样品纯化工艺
采用Design-Expert8.0软件设计MAAs样品纯化的响应面实验, 应用Box-Behnken分别建立SA-2型树脂在不同条件下对吸附率和解析率影响的实验模型[15-16]。分别以样品的质量浓度、上样液流速、上样液pH值这三个因素为自变量, 以上柱吸附率响应值的高低为因变量, 分析各因素间的交互影响, 优化吸附实验工艺。实验设计因素水平见表1。再分别以洗脱液质量浓度、洗脱流速、洗脱液pH值这3个因素水平为自变量, 以解析率响应值的高低为因变量, 分析各因素间的交互作用, 优化解析实验工艺。实验设计因素水平见表2。分别根据吸附及解析实验响应面给出的最优工艺组合进行验证性实验, 每组实验平行进行3次, 取平均值进行比较。
表1 吸附实验自变量因素编码及水平
表2 解析实验自变量因素编码及水平
1.4 数据处理
实验采用Design-Expert 8.0设计实验模型, 结合SPSS17.0软件对其数据进行统计学分析。
1.5 MAAs抗紫外辐射实验
选取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌两种常用菌种, 将菌种进行活化培养处理。实验前先进行预实验验证样品本身是否对其两种菌种正常生长有抑制作用, 再测定样品体外抗辐射活性[17-18]。将一定浓度的MAAs样品加入到已灭菌的生理盐水中, 使用该生理盐水作为稀释液, 稀释菌体浓度至106cfu/mL, 空白对照组使用不加样品的生理盐水稀释菌体至相同浓度。吸取10 mL菌悬液在复合辐照光源下(UVA+ UVB, 离光源30 cm)分别照射0 s、30 s、1 min、2 min、5 min、10 min、20 min, 完成菌悬液的紫外损伤造模。随后吸取菌悬液20mL涂布平板, 经37℃恒温培养3 d后, 平板计数测定活菌数, 以辐照时间为横坐标, 活菌个数的对数值为纵坐标绘制菌种存活曲线图, 从而比较MAAs样品体外抗紫外辐射效果。
2 结果与分析
2.1 静态动力学实验筛选离子树脂
图1为不同型号树脂静态吸附及解析效果图。由图可知, 通过选取的SA-2、001*7、201*7、D61、D152 5种树脂的静态吸附及解析实验, 综合比较吸附及解析效果, 得到SA-2型阳离子树脂为样品MAAs纯化选用树脂。静态吸附量为16.43 mg/g± 0.32 mg/g、吸附率达86.01%±3.04%; 静态解析量为9.06 mg/g±0.92mg/g、解析率为56.63%±1.02%。吸附及解析作用较其他类型树脂效果更佳。
2.2 SA-2型阳离子树脂动态动力学条件优化
2.2.1 动态吸附单因素优化实验
对SA-2型阳离子交换树脂层析纯化紫菜类菌孢素氨基酸进行动态单因素优化实验。在保持样品上样液体积为3BV, 上柱固定吸附时间为4 h的条件下, 研究上样液质量浓度、上样流速、上样液pH各因素对吸附率的影响。
当样品上样液浓度达到3 g/L时, 树脂达到最大吸附率, 此后增大上样液浓度, 吸附率不再增大并呈缓慢降低趋势(图2)。在选择上样液流速在0.5~3 mL/min范围内, 随上样液流速的增大, 样品的吸附率呈明显的下降趋势(图3)。调节上样液pH在3~8的范围内, 随上样液pH的升高, 吸附率呈先增加后降低趋势(图4)。其中, 上样液pH为6时, 样品吸附率最高。这可能是因为MAAs样品本身是一种偏弱酸性的酚类, 在弱酸性环境下易被吸附。
综合考虑, 选择上样样品浓度为 3 g/L的粗提液为响应面优化实验中心点, 分别调节上样流速为0.5、1、1.5 mL/min, 调节上样液pH为5、6、7作为中心组合, 进行响应面优化实验。
2.2.2 动态解析实验优化
选择NH3·H2O溶液作为洗脱液, 在保持洗脱体积为6BV的条件下, 研究洗脱液质量浓度、洗脱流速、洗脱液pH各因素对洗脱率的影响。
在控制洗脱液质量浓度为2%~4%的浓度范围内, 随洗脱液体积分数的增加, 洗脱效果呈先增加后降低趋势(图5)。这可能是因为MAAs样品本身呈弱酸性, 易在弱酸性环境中与树脂结合吸附, 使用弱碱性的洗脱液易将其解析, 而随碱性增强, 解析下的MAAs样品在碱性环境中可发生部分降解[7], 所以出现解析率下降的情况。在控制洗脱流速为0.5~3 mL/min的范围内, 随洗脱流速的增加, 样品的解析率呈明显的下降趋势(图6)。调节洗脱液pH 在2~8的范围内, 当洗脱液的pH增大时, 洗脱率呈先增加后降低趋势(图7)。
综合考虑, 选择洗脱液质量分数为3%的洗脱液作为响应面实验中心点。保持洗脱液pH为5、6、7, 选择洗脱流速范围为 0.5~1.5 mL/min作为中心组合, 进行响应面实验优化实验。
2.2.3 动态吸附实验响应面模型的分析
在对SA-2型阳离子树脂纯化MAAs样品的单因素实验基础上, 采用Design-Expert 8.0软件设计动态吸附优化实验, 实验设计与结果见表3。
表3 SA-2型阳离子树脂动态吸附优化实验设计与结果
对表3中SA-2树脂动态吸附响应面优化数据进行多元回归分析: 得到关于SA-2型阳离子树脂对MAAs样品吸附率的二次多项式回归模型方程为:(%)=78.76–0.095–0.22–2.41–0.13+0.45+0.70–1.702–1.332–4.032。
对动态吸附实验模型进行方差分析: 分析结果见表4, 由表可知, 模型=104.78>0.01, 模型<0.000 1,表明实验回归模型极显著;失拟=2.49<0.05(9.3), 失拟项=0.1993>0.05, 表示模型的失拟度不显著, 模型矫正系数2Adj=0.983 2, 这说明有98.32%的响应值能用该模型来解释, 仅有1.68%的变异无法解释此模型。模型的复相关数2=0.992 6这进一步说明模型拟合优度好。
表4 吸附实验回归模型方差分析
注 : *差异显著,<0.05; **差异极显著,<0.01.下同
表5 吸附试验回归模型各因素显著性检验
对动态吸附实验建立回归模型并对其各因素的显著性进行检验, 检验结果见表5。由表可知, 模型中一次项, 二次项2、2、2以及交互项对吸附率有极显著影响, 其余各因素影响不显著(>0.05)。根据模型数据分析可知, 三因素对吸附率的影响因素顺序依次为:>>, 吸附优化工艺为: 上样液质量浓度3 g/L、上样流速为1.5 mL/min、上样液pH为6。此时, 吸附效率最佳, 吸附率达79.21%。模型优化后回归方程为:
(%)=–50.20800+4.26600+2.37450+43.68675
–0.26000+0.45000+1.39500
–1.700252–5.331002–4.032752
图8为上样流速与上样液pH两因素交互作用对吸附率影响的响应面及等高线图。由图可知, 曲面在上样液质量浓度一定的情况下, 对上样流速与上样液pH两因素对吸附率的影响, 两因素的作用因素极显著(<0.01)。在上样液pH一定的前提下, 上样流速在0.51.5 mL/min范围内变化时样品吸附率值随上样流速的增大呈增大趋势, 上样流速为1.5 mL/min时, 样品吸附率达到最大值; 当上样流速控制一定时, 随着上样液pH的增大, 样品吸附率响应值呈先增大后减小的趋势, 在pH为5~7范围内, 取得最大值。通过吸附模型方程的逆矩阵得到吸附率最大预测值为78.76%, 在此条件下的最佳优化工艺为: 上样液质量为3 g/L、上样流速为1.5 mL/min、上样液pH为6。使用该优化条件下做验证性实验, 得到吸附率79.21%±1.02%。而这与预测值仅相差了0.45%,据此说明该模型可信度高。
2.2.4 动态解析实验响应面模型的分析
在对SA-2型阳离子树脂纯化MAAs样品的单因素实验基础上, 采用Design-Expert 8.0软件设计解析响应面实验模型[15]。综合考察各因素间的相互影响并优化纯化解析工艺。响应面实验设计与结果见表6。
对表6中SA-2树脂动态解析响应面优化数据进行多元回归分析: 得到关于SA-2型阳离子树脂对MAAs样品吸附率的二次多项式回归模型方程为:
(%) =62.76–4.88–2.56+2.85–2.82+0.32
+2.48–12.212–2.502–5.872
对动态解析实验模型进行方差分析: 分析结果见表7, 由表可知, 模型=25.12>0.01, 模型< 0.0002, 表明实验回归模型极显著;失拟=2.69<0.05(9.3),失拟项=0.1818>0.05, 表示模型的失拟度不显著。模型矫正系数2Adj0.9322, 这说明有93.22%的响应值能用该模型来解释, 仅有6.78%的变异无法解释此模型。模型的复相关数2=0.9703, 这进一步说明模型拟合优度好。
表6 SA-2型阳离子树脂动态解析优化实验设计与结果
表7 解析实验回归模型方差分析
注 : 复相关系数2=0.9703; 模型矫正系数2Adj=0.9322; 信噪比=14.739
表8为对解析模型进行的显著性检验, 实验结果如表所示: 模型中一次项、二次项2、2、2以及交互相对解析率有极显著影响。其余项的影响均不显著。各因素对样品解析率的影响顺序为: 洗脱液pH>洗脱液流速>洗脱液质量浓度。模型回归方程为:
%=62.76–2.41+0.7–1.72–1.332–4.032
图9为洗脱流速()和洗脱液pH()对解析率影响交互作用的响应面图和等高线图, 实验结果如图所示, 在洗脱液质量分数固定为3%不变的情况下, 洗脱流速在0.5~1.5 mg/mL时, 随着洗脱流速的增大, 洗脱液对样品MAAs的解析率呈下降趋势, 当洗脱流速保持不变时, 随着洗脱液pH的增大, 样品MAAs的解析率呈先增大后缓慢减小趋势。
采用Design-Expert 8.0 软件计算模型方程的逆矩阵, 得到样品解析率的最大预测值为65.21%, 此时最佳工艺条件为: 洗脱液体积分数为3%, 洗脱流速为1 g/L, 洗脱液pH为7。选取该工艺条件进行验证性实验, 得到样品MAAs的解析率为64.02%±1.27%, 与预测值相比, 相对误差仅为1.19%。说明该工艺条件下解析实验回归模型有效。
2.3 MAAs化合物抗紫外辐射活性分析
实验选用大肠杆菌及金黄色葡萄球菌进行紫外辐照模型, 实验前首先对MAAs样品本身是否具有抑菌作用进行验证性实验, 实验结果见表9。
由表9统计结果可知, 将MAAs样品加入到生理盐水中作为稀释液涂布大肠杆菌、金黄色葡萄球菌中, 培养48 h后计数活菌个数。与对照组相比活菌数无显著性差异(>0.05)。说明MAAs化合物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌本身均无显著抑制作用, 可进行后续实验。
图10为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的存活曲线图。由图可知, 随着紫外辐照时间的延长, 大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的存活率显著降低。而添加了一定浓度MAAs的样品组较空白对照组相比, 在相同辐照剂量的情况下, 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的存活率明显高于空白对照组。例如: 以辐照时间10 min为例, MAAs样品组较空白对照组而言, 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌种存活率分别提高了39.10%、40.58%。由此可知, 样品MAAs可以有效抑制紫外辐射而造成的损伤, 延缓菌种的失活速度。这可能是由于类菌孢素氨基酸这类物质在紫外中波长段UVA (320~400 nm)处及中波长段UVB (275~320 nm)处具有天然的紫外吸收作用, 从而有效的抵抗紫外线的辐射作用[17-18]。这与叶翠芳等人研究的类孢菌素氨基酸具有抗紫外辐射活性作用结果相一致[19-20]。
表8 解析试验回归模型各因素显著性检验
注 : *差异显著,<0.05; **差异极显著,<0.01
表9 MAAs对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌作用
注 :>0.05, 差异无显著性
3 结论
(1) 本文通过静态动力学比较5种树脂的吸附率解析率, 筛选出SA-2型阳离子树脂作为纯化紫菜类菌孢素氨基酸MAAs的最佳树脂。
(2) 采用Design Expert 8.0软件设计了SA-2型阳离子树脂纯化MAAs的动态动力学吸附于解析工艺模型并优化了工艺条件, 对各因素间的交互影响作用建立二次多项式数学模型, 通过响应面和等高线交互分析确定: 各因素对吸附率的影响因素顺序为: 上样液pH>上样流速>上样液质量浓度; 吸附的最佳工艺条件为: 上样液质量浓度为3 g/L、上样流速为1 mL/min、上样液pH为6的条件下吸附率达79.21%。各因素对解析率的影响因素顺序为: 洗脱液pH>洗脱流速>洗脱液体积分数; 解析最佳工艺条件为洗脱液体积分数为3%的氨水、洗脱流速为1.5 mL/min、洗脱液pH为6, 在此条件下, 解析率可达64.02%。
(3) 经SA-2树脂纯化后的MAAs样品用于大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的体外抗紫外辐射实验, 对比在相同辐射剂量处理后菌种的存活率可知, 紫菜中MAAs化合物能有效缓解因紫外线造成的损伤, 具有显著的抵抗紫外辐射活性。
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Optimization of purification process ofmycosporine-like amino acid fromand study on its anti- ultraviolet activity
YING Rui, ZHANG Zhao-hui, DUAN Xiao-shan, ZHAO Xue, HOU Hu, LI Ba-fang
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266023, China)
Objective: To explore the optimal techniques in the separation of mycosporine-like amino acids (MAAs) inwith cation-exchange resins and the study on its anti-ultraviolet activity after purification.Method: In the screening cation-exchange resin through the static adsorption and desorption analytical experiment, response-surface methodology was employed to establish a mathematical regression model with the dynamic adsorption and desorption in the single-factor experiments for SA-2. The ultraviolet-radiation models (UVA and UVB) when compared with blank samples showed that the survival rates of the MAAs groups ofandincreased; this proved that the MAAs after purification had certain anti-ultraviolet activity.Result: SA-2 was found to be the most suitable resin for the mycosporine-like amino acid purification; the obtained adsorption and desorption rates were 86% and 56.63%, respectively. The optimum conditions for the purification were obtained when the sample containing 3 g/L MAAs at pH 6 was mounted onto a column at a flow rate of 1 mL/min; further, it was eluted with 3% ammoniumhydroxide to pH 6 at a flow rate of 1.0 mL/min. The purification process yielded an adsorption and desorption rate of 79.21% and 64.02%, respectively. After the purification of MAAs sample, it had significant resistance to the ultraviolet radiation and the deactivation rate for.and.decreased to 39.10% and 40.58%, respectively.
; mycosporine-like amino acids; SA-2 resin; purification; response surface; ultraviolet-resistant activity
TS201.2
A
1000-3096(2017)02-0071-10
10.11759/hykx20160811002
2016-08-11;
2016-11-26
国家自然科学基金(31272705); 海洋公益性行业科研专项(201505022-5)
应锐(1989-), 女, 研究生, 研究方向: 海洋活性物质, 电话: 18765998051, Email: yingruiouc@163.com ; 张朝辉(1968-), 通信作者, 男, 副教授, 研究方向: 水产化学、海洋生物活性成分及水产品加工, Email: zhangzhh@ouc.edu.cn
Aug.11, 2016
[National Natural Science Foundation of China, No.31272705; Public Science and Technology Research Funds projects of ocean, No.201505022-5]
(本文编辑: 康亦兼)