赤霉酸GA4+7提取预处理酶法工艺研究

赵 南，刘义雄，徐永华，周金龙，宋革命，徐 勇



赤霉酸GA4+7提取预处理酶法工艺研究

赵 南，刘义雄，徐永华，周金龙，宋革命，徐 勇

(江西新瑞丰生化有限公司，江西新干 331300)

考查复合酶预处理工艺在赤霉酸GA4+7提取生产中的应用效果。GA4+7发酵液提取预处理工艺，采用复合酶酶解替代传统的重金属盐类絮凝，配合后续工段的调整，形成完整的赤霉酸GA4+7提取新工艺。相比传统工艺，新工艺提取收率增幅达23.3%，极大提高产品的收率水平，适用于工业化生产。

赤霉酸GA4+7；预处理；复合酶

赤霉酸GA4+7属赤霉素类植物生长调节剂，是GA4和GA7的混合物，其对于植物的生理学功能与GA3不同。在100多种赤霉素同系物中，GA4+7和GA3更具使用价值和商业价值，尤以前者为甚[1]。目前GA4+7产品在国内和欧美一些国家有着较广泛的应用。随着其应用领域的不断拓展，GA4+7产品的市场容量亦逐步扩大。

在工业微生物领域，发酵液往往需经过预处理后进入下游提取[2-3]。常见的预处理手段有调节pH等电点法，加盐絮凝沉降蛋白法，助滤剂(如硅藻土、珍珠岩粉)法，絮凝剂聚合法等。对于赤霉酸类GA3发酵液预处理，中科院赵彦修等[4]通过添加硫酸铝获得良好的效果，此外调节pH等电点法应用也较为普遍。而赤霉酸类GA4+7发酵液组分与GA3相比差异较大，目前通行的预处理工艺是采用黄血盐、硫酸锌2种盐类协同作用使料液产生絮凝以实现固液分离。该工艺的特点是滤液清澈、过滤速度快。但同时存在较大缺陷，即盐类本身对产品产生的破坏，加之絮凝结团易导致菌丝内产品释放受阻，顶洗不彻底，影响收率；添加盐类后极大提高滤液渗透压，无法应用先进的膜分离工艺进行下游浓缩，只能选择落后的薄膜蒸发工艺；后者工作能耗大，料温高(50 ℃左右)，产品易受热被破坏；滤渣内富含重金属物质，存在环保问题。

本研究拟建立全新的酶法预处理工艺，以提高收率，更新浓缩方式，解决环保等问题。

1 材料与方法

1.1 材料

赤霉酸GA4+7发酵液，江西新瑞丰生化有限公司生产；纤维素酶、溶菌酶、酸性蛋白酶，市场购买；中速定型性滤纸，市场购买；722N可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；中试纳滤膜设备ZNF2540L-1，厦门征成膜清洗科技有限公司；纳滤膜芯NF-90(分子量200)，厦门征成膜清洗科技有限公司；高效液相色谱仪LC-10ATVP，日本岛津。

1.2 方法

1.2.1 复合酶及作用条件的确定

用正交试验法[5]研究了复合酶的最佳组合以及最适作用pH。

1.2.2 滤速测定

以单层中性定性滤纸作为介质，自然过滤5 min，收集滤液，计量体积作为滤速参数。

1.2.3 滤液质量测定

用722N可见分光光度计在666 nm波长条件下，以蒸馏水空白归零修正，测定滤液吸光值，滤液质量与其呈负相关关系。

1.2.4 纳滤膜分离浓缩方法

将NF-90纳滤膜芯安装于小试膜设备上，成一纳滤系统。滤洗液过膜，控制进膜压力16~18 bar，出膜压力13.7~15.3 bar，透析液为水及小分子物质，弃去。回流液内含产品重回原料储罐中循环处理，达到浓缩目的，当其体积为初始滤液体积1/6左右时，终止纳滤，收集浓缩液。计量体积，检测浓缩液含量，考查收率。

1.2.5 HPLC测定含量

StableBond C18反相柱；柱温：35 ℃；检测器：UV 210 nm；流动相：甲醇67%、水33%、甲酸0.05%；流速：0.7 mL/min；进样体积：20 μL。进样浓缩液，测定GA4+7的含量。

2 结果与分析

2.1 复合预处理酶的选型及配伍组分比例确定

赤霉酸GA4+7发酵液内固形物组分主要为目标产物、菌丝体(内含胞内物质及部分目标产物)、培养基残料(蛋白质、糖类、无机盐等)。选择纤维素酶、溶菌酶作用于菌丝体，促其破壁释放目标产物。残料中蛋白质具有一般胶体性质，选择酸性蛋白酶对培养基残料中蛋白质进行适度水解，使其絮凝沉降成为滤渣。本研究在常温、复合酶添加比例0.05%，酶解1 h的条件下预处理GA4+7发酵液，以原工艺(加盐絮凝)为对照，考查新工艺的滤速、滤液质量、效价等指标，确定最优预处理复合酶配方。

2.1.1 正交试验

设定纤维素酶、溶菌酶、酸性蛋白酶、pH作为4个因素，复合酶总量按6份计，各因素以1份、2份、3份设定3个水平，pH分别设定4.0、5.0、6.0 3个水平。对4个因素进行正交试验(表1)。

表1 正交试验

注：对照效价以100%计，以下该指标数据处理与此相同。

表2 结果统计

表2数据表明，当将发酵料液pH控制在6.0时，各项指标数据均处于最高水平；就核心指标效价而言，纤维素酶3份、溶菌酶1份、酸性蛋白酶2份配伍组合效果最优；与对照组相比，各组合对滤速、滤液质量的影响并不明显；根据各因素随水平变化表现的趋势看，纤维素酶可在上限基础上适当增加比例，溶菌酶可在下限基础上适当减少比例，酸性蛋白酶于2水平处效果最优；经修正后，确定酶解pH 6.0最适控制点，复合预处理酶配伍组合为纤维素酶52%、溶菌酶33%、酸性蛋白酶15%。

2.1.2 配方效果验证

将上述配制复合酶添加于发酵液中酶解，与对照盐析预处理工艺进行对比，结果见表3。

结果表明酶解预处理工艺具有良好的增产效果，同时对过滤工序的运行工效及滤液质量并未产生不利影响。

2.2 复合预处理酶添加比例确定

在确定复合酶配方基础上，通过添加系列梯度用量复合酶进行小试，考查收率、滤液质量等指标，确定适用于生产实际的最佳复合酶用量。

表3 酶解工艺与原工艺效果对比

表4 复合酶梯度用量小试研究

由表4可知，复合酶添加用量为0.08%时，在保证过滤工序进度和滤液质量的前提下，能大幅提高过滤工序的收率水平。

2.3 下游浓缩工艺重建

传统滤液因富含盐类，渗透压较高，故选择薄膜蒸发法浓缩。但此法50 ℃左右的高温对产品有一定程度的破坏，且能耗较大，运行成本高。由复合酶替代盐类进行发酵液预处理后，滤液渗透压大幅降低，可应用先进的膜分离工艺进行下游浓缩。通过考查纳滤透析通量变化、工作时间、浓缩倍数、工段收率等指标，评估纳滤膜分离的浓缩效果。

2.3.1 纳滤膜浓缩运行功效考查

复合酶预处理后，收集板框滤液，采用中试纳滤膜分离系统进行分离浓缩。以物料浓缩至6倍作为控制终点，监测期间通量变化，同期以自来水进膜分离为对照，确定纳滤膜分离的浓缩适用性。结果见图1、图2。

2.3.2 纳滤浓缩对收率的影响

将同一板框滤液均分2组，分别采用纳滤分离、薄膜蒸发2种方式进行浓缩，结果见表5。

由表5可知，相比传统薄膜蒸发法，纳滤分离工艺无论是运行工效，还是技术指标都具有明显优势。

表5 纳滤、薄膜蒸发工艺浓缩效果及收率比较

图1 浓缩液体积随时间变化趋势

图2 通量随时间变化趋势

2.4 新工艺整合后试产验证效果及对技术指标的影响

整合以上试验结果形成完整工艺体系，并应用于工业化试生产，同时采用原工艺作为对照，连续8批次验证结果见表6。

表6 新工艺试生产水平验证

由表6可见，应用复合酶预处理结合纳滤浓缩工艺能极大提高板框、浓缩二工段收率，后续工段无异常，对总收率水平的提升效果明显。之后各批成品检测数据显示，所有批次产品质量指标均符合标准要求，进一步证明新工艺适用于规模化生产。

3 结 论

预处理酶作为一种具有催化能力的蛋白质，应用于工业微生物提取领域是创新式尝试，并获得了良好的试验效果。本文针对赤霉酸GA4+7收率水平不高的瓶颈问题，通过酶法研究，筛选出预处理复合酶最优组合，即纤维素酶52%、溶菌酶33%、酸性蛋白酶15%，确定了适宜的处理条件pH 6.0及0.08%的添加比例。通过酶解作用，促进菌丝体内目标产物充分释放，改善发酵液流变状态，利于后提取工序顺畅衔接，在提高产品总收率、降低单位生产成本的同时能够对原有工艺体系进行重建，淘汰落后的高能耗生产方式，避免了盐析滤渣产生的重金属污染问题，最终实现经济效益、能源效益、生态效益的全面提高。通过酶法工艺产生的板框滤渣富含蛋白质等营养物质，后续研究将对内含物质进行组分分析，探索建立适宜的加工方法，把滤渣处理成为符合相关要求的动物饲料或作物有机肥，变废为宝，推动赤霉酸GA4+7循环经济进一步发展。

[1] 颜方贵, 秦杰, 何增国, 等. 赤霉素A4、A7的研究进展[J]. 微生物学通报, 1994, 21(3): 163.

[2] 俞俊堂, 唐孝宣, 邬行彦. 新编生物工艺学[M]. 北京: 化学工业出版社, 2009: 1－21.

[3] 俞文和. 新编抗生素工艺学[M]. 北京: 中国建材工业出版社, 1996: 10－23.

[4] 赵彦修, 张露茜. 赤霉素发酵液的絮凝预处理研究[J]. 微生物学通报, 1994, 21(1): 3－5.

[5] 廖永平. 质量管理常用统计技术与方法[M]. 北京: 中国科学技术出版社, 1999: 198－204.

Study on the Effects of Enzyme Pretreatment on Extraction of GA4+7

ZHAO Nan, LIU Yixiong, XU Yonghua, ZHOU Jinlong, SONG Geming, XU Yong

(Jiangxi New Reyphon Biochemical Ltd., Xingan 331307, Jiangxi, China)

The effect of pretreatment technology with complex enzyme on gibberellinGA4+7 extraction was investigated. The extraction pretreatment process of the gibberellins GA4+7 fermentation broth changes from the traditional heavy metal salts flocculation to the complex enzyme hydrolysis, combined with the subsequent section adjustment, and is a new gibberellins GA4+7 extraction technology.Compared with the traditional process, the extraction yield increased by 23.3%.The new technology can greatly improve the yield of products, and is suitable for industrial production.

gibberellins GA4+7; pretreatment; compound enzyme

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2017.02.07

TQ450

A

1009-6485(2017)02-0034-04

江西省优势科技创新团队建设计划项目(20152BCB24012)

赵南(1973—)，高级工程师，江西南昌人，从事工业微生物菌种、发酵、提取研究。

2017-03-08。