独脚金内酯商业化用于植物保护的潜力

2017-05-24侯文君编译

世界农药 2017年2期

侯文君编译

独脚金内酯商业化用于植物保护的潜力

侯文君编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

独脚金内酯(SL)是一类天然的，也可合成的化合物，具有有趣的生物学特性以及用于农业的潜力。在过去几十年中科学界一直很关注此类物质，并对其进行了大量的研究。研究已证实此类物质具有激素活性，能调节植物株形；是诱导寄生杂草种子萌发的刺激物；是寄生植物识别寄主植物的主要因素；是信号物质，有助于丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi)识别和在植物根部定植。独脚金内酯具有的多种生物学特性激发了科研人员研究和应用的兴趣，特别是用于农业，最近农化公司也开始关注。然而，尽管独脚金内酯具有以上诸多特点，但实际应用受到很多方面的限制，如从植物根分泌物获取的量低，合成费用高，对非靶标的影响不明确，没有专用的登记立法。根据使用类型，SL有不同的登记程序：⑴SL被用作植物激素或自杀性萌发的天然除草剂，可以按植物保护产品登记程序进行登记；⑵用作激活植物防御机制的化合物，以植物强壮剂进行登记；⑶用于植物促进营养吸收或营养的有效利用，以植物生物刺激剂进行登记。本文根据现有的知识讨论独脚金内酯未来实际应用潜力。

1 独脚金内酯的发展现状

最早被确定的SL为独脚金醇(Strigol)、乙酸独脚金内酯(Strigylacetate)，是在1996年从非独脚金属(spp.)寄生寄主——棉花根系分泌物分离得到的独角金萌发刺激物。后来，从独角金寄主，即高粱、玉米和黍稷的根系分泌物中鉴定出独角金醇。自此，从一些寄主和非寄主植物的根系分泌物中分离得到许多其他的SL。它们是寄主和寄生物间互作的主要因素，如寄生物种子不能萌发，因此没有此类刺激物寄生物无法进行寄生循环。这些物质对根寄生物种子萌发有很强的诱导作用，作用浓度为10－7~ 10－15M。寄生物在种子萌发后，黏附到许多种类植物的根部，获得营养和水，致使作物受损。列当(spp.和spp.)是全寄生植物，寄生于全球重要的农作物上，如豆科作物、十字花科植物、向日葵、大麻、烟草和番茄。独角金属(独角金)是半寄生植物，对谷类作物能造成巨大的损害，主要发生在撒哈拉沙漠以南地区。在只知道SL的萌发刺激特性后，人们提出一个有趣的问题，为什么植物会分泌使“敌人”定植于其体上的SL。因此，假设SL还具有除寄生识别外的功能。后来研究发现它们能诱导共生丛枝根真菌的菌丝分枝和孢子萌发，这证实了以上假设是对的，SL对植物具有有益的作用。丛枝根真菌为土传专性共生菌，能使植物对有机磷和其他矿物的吸收增加，使植物持续生长。这些真菌渗入和定植于植物根部后，生长出高度分支的结构，被称作丛枝，是营养交换点。丛枝根真菌要成功定植于寄主植物依赖于寄主植物根和真菌菌丝间联系网络的建立，这受SL的调节。虽然SL是丛枝根真菌识别寄主的重要信号，在SL的作用下大部分陆地植物形成共生体，但有一些非丛枝根真菌寄主，如拟南芥和白羽扇豆，也产生SL。从这2种植物中分离鉴定出的SL或其代谢产物为新颖类别激素，调节植物分枝。这表明SL可能在植物体内具有其他未知的功能，如对植物正常的生长和发育起一定作用。已有文献报道发现SL具有激素功能。最近科技人员在研究它们对植物生长和发育的影响。已报道SL能促进一些作物和杂草的种子萌发，影响植物根的分支和次级生长，参与根瘤菌-豆科植物的相互作用。

2 农业应用的潜力

由于SL对数个生物系统有作用，科学家已努力开发这些化合物的实际应用，主要为农业用途。

2.1 寄生杂草的管理

最初提出的SL应用包括寄生杂草的管理，称为“自杀性”萌发。如果寄生杂草种子在萌发后，在附近找不到寄主根，就只能存活很短时间。“自杀性”萌发策略的思路是在没有寄主的情况下刺激寄生杂草种子萌发，然后萌发种子死亡。用此方法减少寄生杂草种子银行可能是一个长期过程。在较长一段时间内都在尝试此方法，但许多问题阻碍了其实际应用，这包括合成足量产品的费用高；化合物在土壤中难以迁移，因此难以接触到许多种子；化合物不稳定。然而，新技术的出现(例如纳米技术、生物技术、先进的传递系统)有可能解决这些问题。

2.2 生物肥料

SL有助于共生真菌和根瘤菌在作物根部定植，从农业的角度出发，SL可被作为“间接生物肥料”。丛枝根真菌在与植物共生关系中的主要作用为传递矿物营养，特别是磷肥。在全球的许多地区，土壤中此重要矿物营养素的浓度或可利用度有限，这严重影响植物的生长和健康。丛枝根真菌能提高磷肥的吸收，促进植物的生长。由于丛枝根真菌在植物获取磷肥中具有重要作用，因此在磷肥有限的田间生长的植物根系分泌物比在磷肥充足的环境中植物根系分泌物对丛枝根真菌的刺激性更大。

2.3 植物激素

在发现SL能抑制植物腋芽生长后，进行了大量相关研究。研究发现SL也能影响植物根系构型，特别是分枝、次级生长、下胚轴伸长、根的生长、生节和种子萌发，主要和其他激素共同作用。这些激素协同作用使植物对温度、遮阴、日长和营养的利用率等环境因素做出适宜的响应。SL的分泌率对土壤中的营养水平高度敏感，在低磷条件下，植物产生的SL增加很多。植物对SL生物合成和分泌具有强的调节作用，这可能是植物在不同的磷肥水平下茎和根生长和构型变化的机制。因此深入了解这些机制才可能在农业中实际应用SL来调节植物的生长和形状，增加植物的适合度，以最好的状态生长、发育。

3 独角金内酯现有生产方法和受限因素

3.1 已知的天然独脚金内酯

到目前为止，已从植物根系分泌物中分离和鉴定了约20个天然SL，此数量将会继续增加。不同植物种类和同一作物的不同品种产生不同的SL和/或其混合物。所有已知的SL结构相似。此类物质的核心部分为三环内酯(ABC部分)，通过烯醇醚桥与丁烯酸内酯基团(D环)相连(图1)。在天然SL中，5-脱氧独角金醇(5DS)首次从百脉根()的根系分泌物中分离得到。5DS结构简单，被作为其他Ss的常见前体。Solanacol首次从烟草的根系分泌物中分离得到，是番茄的主要SL之一。列当醇和其乙酸盐是植物中最常见的SL。目前，SL一般为对ABC核心进行修饰的化合物，如avenaol，或缺少三环内酯的物质，如heliolactone或carlactone。目前有18个具有三环内酯(ABC环)和2′-构型丁烯酸内酯环(D环)的SL。天然SL分为2类：独角金醇和列当醇衍生物，2类物质的B-C环连接的立体化学结构不同。独角金醇类SL的C环为位(向上，8b构型)，而列当醇类SL的C环为位(向下，8b构型)。

3.2 天然独脚金内酯的分离

每个植物每日的SL产量非常适中。对棉花幼苗进行的研究表明每株植物每天独角金醇和乙酸独脚金内酯平均分泌量分别为15、2 pg-1，然而要收集水培寄主植物根系分泌物需要能栽培许多植物的试验装置。此“天然”生产方法不适宜于SL的批量生产。已评估了拟南芥和水稻细胞培养悬浮液作为细胞工厂生产SL的能力。然而，虽然2个细胞品种都能够生产和在培养基中释放许多不同的SL，但是在此系统中收集大量的化合物不太可能，这是因为SL降解速度快，在培养基中不能积累。虽然没有进一步扩大此系统规模，但试验已表明植物细胞培养可能具有批量生产SL的潜能。从根系分泌物中分离SL很费力，需要色谱分离纯化。此外，由于SL的结构和立体化学结构复杂，其有机合成还在攻克中，所以SL难以商业化或商业化价格非常高。最近，一些SL的生物合成的研究取得了重大进展，预期不久将会确定更多调控其他SL合成的基因，制定出切实可行的SL生物合成的代谢工程。SL是从全反式--胡萝卜素经9-顺式--胡萝卜素合成，而中间体carlactone(图1)被认为是其他SL的前体。原则上，通过选取适宜的微生物，经培养，生化合成SL是可能的，这些微生物的培养成本低，且在培养基中释放生物合成化合物。依据目前有关SL作用机制和生物合成的知识和研究进展，可预见以生物代谢工程为可行的合成方法已为时不远。这将为天然SL低成本大规模生产铺平道路，可用于基础或农业应用。此外，了解SL转运组织的特性将有助于更好地了解SL在作物体内的功能，为调节SL释放到土壤中提供可能性。

注：根据立体化雪构型，独脚金内酯被分为2类：独角金醇和列当醇类；Avenaol和heliolacone的结构特征与独脚金内酯的相似，但二者是否属于独脚金内酯类还需要讨论；Carlactone是独脚金内酯生物合成前体。

3.3 作用机制和稳定性

SL在生物系统中活性高，而在土壤中不稳定。独角金醇和其类似物中存在高反应活性的烯醇醚结构，故这些物质在碱性介质中易于水解，生成ABC-甲酰内酯和5-羟基丁烯羟酸内酯(D-OH)(图2)。GR24(立体异构体混合物)为SL合成类似物，被用作大多数生测试验的通用标准，pH 7时其半衰期为10 d，5DS约为1.5 d。在24 h内，5DS的衍生物甲酰基三环内酯的量迅速增加，再随着时间的增加逐渐减少，这表明甲酰内酯可能被氧化和水解而进一步降解。相比较，5DS在32 ℃的丙酮中放置21 d其浓度没有变化。SL在土壤中的不稳定性关系到其田间的应用，化合物不能在土壤中积累。而适当剂型能部分抑制化合物水解。SL类化合物制剂化的主要目标是调整化合物稳定(有效)和不稳定性(阻止积累和污染突然)间的尺度。最近，Kannan和Zwanenburg建议利用SL的不稳定性引入防除寄生性杂草的新概念，即在SL起效前分解此萌发刺激物，使种子不能萌发。他们在自然条件中应用硼砂和硫脲，促进SL的分解，使寄生性杂草种子不能发芽。

图2 独脚金内酯水解为2部分结构：甲酰基三环核和羟基丁烯羟酸内酯

4 合成生产的持续性

SL的合成正在经受挑战，其不但费时也费钱。目前合成的SL用于农业还不可行。然而，正如Zwanenburg和Pospisil在最近的综述中强调，SL的全合成是成功解析这些天然产品的最可靠和推荐的方法。天然的SL具有很复杂的结构，难以以克的数量级规模合成。数个天然SL全合成已完成，但其合成途径包括数步反应，通常多于20步。为了研究SL对不同生化过程的影响，设计和制备了模型化合物。其先决条件为SL类似物的结构应比天然SL(更)简单，但生物活性要保持最好。合成SL可被分成2大类：⑴类似物，其结构与典型的天然SL的非常相似；⑵模拟物，其结构更简单，其生物活性类似于SL。

4.1 类似物

SL类似物在生测研究中具有重要作用。GR24是SL通用标准，以克数量级规模的立体异构体混合物生产，对映体的手性分离法和对映选择性合成法也已被提出，但生产成本较高是其一劣势。在GR衍生物家族(GR24是知名代表)(图3)中，设计结构简单、有生物活性化合物的思路导致GR5和GR7的合成，GR7被用作防治独角金(S.asiatica)的自杀性萌发剂。此刺激剂以10 mg/L用于装土壤的盒子中(对应于约750 g/hm2)。此类物质的稳定性再次成为重要问题。pH＜7.5，GR7的半衰期约为100 h；pH越大，稳定性越小。试验表明pH和湿度对GR7和GR24刺激种子萌芽的作用有很强的影响。值得一提的是Nijmegen-1，此物质可从简单的原材料，经较少几步反应，较容易地合成，其萌发活性相当于GR24。已对Nijmegen-1进行了田间自杀性萌发试验，建议用量为约6.25 g/hm2，费用约为100 000欧元/hm2。目前，高成本阻碍了SL技术在田间的实际应用。本着设计简单而有活性分子的思路，得到了一系列从成本低的酮衍生来的类似物。盆栽试验表明四氢萘酮衍生物(图3)具有很好的效果。EGO10是吲哚基衍生的SL，从易得试剂经3步反应轻松地合成，被用作植物激素，调节植物分枝。在设计具有萌发活性的新的类似物中，一个氧原子被一个杂原子取代，成功合成了2类活性物质，即亚氨SL类似物和strigolactams。

注：GR24一般用作生测标准物，GR7和Nijmigen已用于田间，EGO10是吲哚基衍生物，模拟物为含有D环的结构简单的化合物。

4.2 模拟物

被称作“SL的模拟物”是缺少ABC骨架，但保留了通过醚或酯功能键连接到另一基团的D环的化合物。“模拟”一词来自于化合物的活性与SL的相仿。由于结构简单，活性高，此类物质被认为是具有农业应用前景的候选物。一类具有种子萌发刺激活性的模拟物在C-5有一个芳氧基取代基，由于主要抑制植物分枝所以被命名为“debranones”(植物不分枝活性的呋喃酮)。种子对debranones的反应中等，而对氯苯氧基物的活性最高。另一类SL模拟物在D环的C-5上有一芳酰氧取代基。这些SL模拟物对种子的萌发具有中等的刺激作用，但对弯管列当()和种子有显著的活性。目前正在测试这些芳酰氧SL模拟物对植物分枝的抑制活性。报道C-2′为S-芳基，C-3′为甲基的一个SL模拟物有非常高的活性。有趣的是，同一研究人员合成了一个名为AR36的化合物，此物质结构为D环和非环不饱和链相连(图3)。此物质对豌豆分枝具有高的抑制活性，但不诱导根寄生杂草种子的萌发。这个例子很好地说明了通过适宜的分子设计可使化合物保留有益的作用而去除有害的影响。也可以通过已有化合物的试验库来搜寻田间应用的新的、有效的、选择性生物活性化合物。建立了基于酵母的高通量筛选系统，得到了与SL活性相当的潜在候选物。然而，只有获得更多有关合成可行性、生产成本、毒性和土壤中持效性的信息后，它们才有可能应用于农业。

4.3 抑制剂

SL具有多种功能，搜寻简单的SL兴奋剂或拮抗剂可能也对基础研究和农业应用具有一定的作用。参与SL生物合成的大部分酶已被知晓，生物合成抑制剂已被确定和成功应用。然而，探求感知抑制剂仍处于初级阶段。到目前为止，所有确定的SL兴奋剂具有D-环或其衍生结构，唯一例外的为cotylimide(CTL)，其结构不含有D环。适宜的抑制剂可能能很好地控制和调整SL的作用。

4.4 合成独脚金内酯对根围的影响，对环境的威胁、稳定性和其降解产物可能的影响

在SL被确定为植物激素后，大量的科学研究已表明SL的激素活性能控制多种植物性状。一般来说，SL能使植物适应恶劣的土壤环境，许多科学著作提出把SL用于农业土壤中以增加作物产量。然而，SL对土壤固有的微生物群的影响未知。通过研究分子在不同pH水介质中的稳定性、光稳定性和副产物，预测先导化合物的生物降解性将会令人满意。SL在土壤中不稳定，故在土壤中存留时间短，且不会积累。然而，是否SL水解产物会影响土壤微生物(土壤微生物的结构、丰度和功能)仍需要研究。

5 对非靶标的影响

由于可得到的SL量少，所以对其对非靶标影响的研究有限。其中，一些试验研究了最大浓度为8.5×10-5的一系列浓度的GR24对非靶标的影响，结果为其抑制尖孢镰刀菌()、核盘菌()和灰葡萄孢菌()等植物病原真菌径向生长，促进菌丝的分枝。然而，此活性浓度远大于植物根产生的天然SL的生理量。还需要进行许多完整而详尽的生测试验来研究SL的应用对多种非靶标生物的影响。要进行这些生测，就需要大量的化合物，化合物生产成本高使这类生物评估试验没有经济可行性。

6 管理

伴随着农业用途的新的天然分子的发现，产生了新的科学问题、方法论难题和管理问题。对于未来如何管理新分子的使用，第一步要做得就是确定化合物的特性。鉴于以上提及的SL的生物特性，未来对其农业使用的监管可能会存在多种情况。因为这些化合物可以被用作植物保护产品、或植物强壮剂或生物刺激剂，所以会以不同的登记程序进行登记(表1)。

表1 根据农业用途对独脚金内酯的分类

6.1 植物保护产品

SL可以在植物组织中迁移，且作用浓度非常低，根据这两个典型的特点，可以以植物激素进行登记。此外，虽然SL不直接杀死寄生杂草种子，但当用于自杀性萌芽时，可能按天然除草剂进行登记。在以上两种情况下，在欧洲就根据(EC)No.1107/2009号法规进行监管，包括对植物保护产品的上市，对活性物质、安全剂、增效剂和助剂(adjuvant and coformulant)的评估和授权。在植物保护产品上市前，要根据欧洲议会和理事会条例()评估其中的活性物质的安全性。除了对危害植物的生物具有防控作用外，活性物质和其在食物中的残留不应该对人和动物的健康有危害，对环境和非靶标不会有不可接受的影响。这些分别是(EC)No.1107/2009号法规附件Ⅱ的3.6、3.7和3.8所要求的，也是No.544/2011号法规要求的，是评估化合物对人类健康影响、毒性和生态毒性，以及活性物质在环境中的行为和归属的程序。

要登记一个活性物质，生产者必须向成员国提交申请，付费以及提供活性物质满足登记要求的一套完整资料。从提交申请到批准的公布约需要2.5~3.5年，根据登记所需资料的复杂性和完整性的不同，此时间的长短有很大的变化。植物保护产品至少含有一个被批准活性成分，在其上市或使用前，必须根据相关法规和程序被所在成员国授权。

根据欧盟不同国家特定的农业气候特征，欧盟被分为3个区进行授权(南部、中部和北部)。成员国代表其所在区的其他国家对申请材料进行评估，有时代表所有区。与(EC)No.545/2011号法规要求的一样，(EC)No.1107/2009号法规要求提交的植物保护产品的强制性数据有农艺效果、毒性和生态毒性和残留研究。据笔者所知，到目前还没有进行所要求的、必须的有关SL对水生(例如水藻、水蚤和鱼)和陆生生物的急性毒性和慢性影响的试验。植物保护产品登记和授权程序漫长而费力，需要许多专家的支持；此外，生产者必须向主管机构提供大量产品信息以供评估和授权，故花费很高。低影响的产品登记费用为数十万欧元，新的复杂的产品需花费几百万欧元。

6.2 植物强壮剂

SL对植物种子具有独特的作用机制，也被用作植物强壮剂。其定义为激发植物的防御机制，保护植物免受有害生物的危害，但也能保护植物不被非寄生性生物侵害。植物强壮剂是界于肥料和植物保护产品间的物质，没有明确适用的欧洲登记法律。目前，不同的国家对其有不同的命名，以适用于植物保护产品的(EC)No.1107/2009号法规或监管肥料的(EC)No.2003/2003号法规进行管理。此外，一些成员国已制定了允许此类产品用于农业的法规，其他一些国家甚至把植物强壮剂归为化妆品和食品添加剂的管理范畴。在与成员国合作的情况下，EC Service详细指定了“低风险植物强壮剂的数据要求”工作文件，这有助于明确植物强壮剂的授权程序。根据此文件，首次评估对人类、动物和环境风险低的植物强壮剂时，需提交的资料很少。如果首次评估认为此产品可行，根据实际情况可能需要提供进一步的信息。然而，有关肥料的(EC)No.2003/2003号法规正在修订中，此次修订主要是要扩展所适用肥料的范围，包括植物生物刺激剂，植物强壮剂也可归入植物生物刺激剂类中。

6.3 植物生物刺激剂

植物生物刺激剂被定义为当用于植物或根围，会刺激植物的天然生理过程，有利于营养的吸收，增加营养利用率、对非生物胁迫的耐性，提高作物的品质。此类物质不属于植物营养成分，也不是具有公布的和特定的植物健康功能的产品。最近对不同国家对此类物质的管理进行了调查，发现不同国家间存在相当大的差异。例如在一些国家，植物生物刺激剂的上市无需授权，而大多数国家要求提交毒性、生态毒性、风险评估、农艺效果和分析方法等详细的材料。欧盟新法规要求，由第三方对提交的植物生物刺激剂材料进行评估。因此，不久以后，如果在欧盟把SL登记为植物生物刺激剂的话，要由评估单位对SL进行评估。利益相关者要提交确定活性物质，证明防效、无害性的试验材料。然而植物生物刺激剂的管理程序一般比植物保护产品的简单。欧盟肥料新法规还没有生效，植物生物刺激剂的上市将会遭遇国家立法，且不同国家所立法规会不同。