碳酸氢盐对嗜氢和嗜乙酸产甲烷菌的影响机制

张玉鹏,李建政*,刘凤琴,刘 崇,2,施 恩(.哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 50090；2.民政部一零一研究所,北京 00070)

碳酸氢盐对嗜氢和嗜乙酸产甲烷菌的影响机制

张玉鹏1,李建政1*,刘凤琴1,刘 崇1,2,施 恩1(1.哈尔滨工业大学,城市水资源与水环境国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150090；2.民政部一零一研究所,北京 100070)

分别以H2/CO2和乙酸盐为底物,研究了HCO3–浓度([HCO3–])对厌氧活性污泥中嗜氢产甲烷菌(HM)和嗜乙酸产甲烷菌(AM)活性的影响,并从群落结构、反应动力学和热力学等方面进行了分析.结果表明,0.05～0.20mol/L的[HCO3–]对HM的产甲烷活性具有刺激作用,刺激浓度随着系统氢分压的升高而降低.但高[HCO3–](0.05～0.20mol/L)对AM的产甲烷反应有抑制作用.HM中的Methanobacterium formicium和AM中的Methanosarcina mazei是厌氧活性污泥的优势菌群.随[HCO3–]的升高,M. formicicum的丰度逐渐增加,而M. mazei的丰度则呈现先增加([HCO3–]≤0.10mol/L)后降低([HCO3–]≥0.15mol/L)的趋势.[HCO3–]可显著改变发酵体系的pH值和产甲烷反应的吉布斯自由能变化,进而影响HM和AM的产甲烷效能.

厌氧活性污泥；碳酸氢盐；产甲烷反应；嗜氢产甲烷菌；嗜乙酸产甲烷菌

高浓度有机废水的厌氧生物处理,能耗低,且可回收CH4和H2等可再生能源,得到了广泛研究和应用,但也存在反应速率低、处理时间长等不足,而且系统易受水质水量变化的影响[1-2].如何进一步提高厌氧处理系统的效能和运行稳定性,一直是厌氧生物处理技术的研究热点.

有机废水的甲烷发酵是在产酸发酵、产氢产乙酸和产甲烷等功能菌群的共同参与下完成的,一般可分为产酸阶段和产甲烷阶段[3].产酸发酵菌群和产甲烷菌群在生理生态特性上有显著差别[4].如产酸发酵菌群可在pH值为4～10范围内生存[5-6],而产甲烷菌群的生长pH值为6.8～7.2[7].产甲烷菌是严格厌氧微生物,只能利用乙酸和一碳化合物进行呼吸和生长,与产酸发酵菌群相比,产能效率低,生长缓慢,且对环境变化敏感,其产甲烷代谢被认为是甲烷发酵过程的限速步骤[8].为维持甲烷发酵系统的稳定运行,必须将产酸发酵菌群的生长代谢水平限制在与产甲烷菌群相匹配的水平上,系统的处理效能因此受到了很大影响[9].

在厌氧生物处理系统中,碳酸氢盐(HCO3–)既是嗜氢产甲烷菌(HM)的碳源,也是嗜乙酸产甲烷菌(AM)的产物,对系统的 pH值还有调节作用[10].关于 HCO3–对厌氧消化系统 pH值的调节作用已有大量报道,但就其对AM和HM的影响机制研究尚不够深入[11-13].本文分别以H2/CO2和乙酸钠为底物,在不同碳酸氢盐浓度([HCO3–])下,对厌氧活性污泥进行培养,考察HM和AM的产甲烷代谢特征,并从特征微生物、反应动力学和产甲烷反应的热力学等角度,探讨[HCO3–]对厌氧活性污泥中产甲烷菌群的影响与机制,以期为厌氧生物处理系统的调控提供参考.

1 材料与方法

1.1 厌氧活性污泥

实验采用的厌氧活性污泥,取自本实验室的一个厌氧折流板反应器(4格室)的第3格室.在进水COD 8000mg/L、HRT 36h和35°C条件下,该格室的比产甲烷速率为 2.5L/(L·d)[14].用于测试的污泥样品,其挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)和悬浮固体浓度(MLSS)分别为4.5和8.66g/L.

1.2 培养基

基础培养基(mg/L):Na2HPO4·2H2O 530, KH2PO4410,NH4Cl 300,CaCl2·2H2O 110, MgCl2·6H2O 100,NaCl 300,FeCl2·4H2O 4.5, EDTA·Na21.65,微量元素液1mL,维生素液1mL, L-半胱氨酸 500,0.1%刃天青 1mL[15].其中,微量元素液(mg/L):H3BO450,ZnCl250,CuCl2·H2O 38, MnCl2·4H2O 50,CoCl2·6H2O 50,NiCl2·6H2O 92, Na2SeO3·5H2O 26,Na2WO4·2H2O 33,Na2MoO4⋅2H2O 24;维生素液(mg/L):生物素4,烟酸 40,维生素B6 10,维生素B2 20,维生素B1 40,维生素B12 20,叶酸 20,硫辛酸 40,对氨基苯甲酸 20.

乙酸培养基:在基础培养基中加入 20mmol/ L的乙酸钠.

1.3 甲烷发酵实验

对活性污泥的甲烷发酵测试,采用批式发酵方式进行,发酵容器为 250mL的血清瓶.分别以乙酸盐和H2/CO2为碳源的培养体系,均设置5个[HCO3–]梯度,即0、0.05、0.10、0.15和0.20mol/L,每个浓度下设置 3个重复.乙酸培养基用氮气吹脱 15min后,每瓶分装 100mL.在氮气保护下,按照设计浓度加入NaHCO3,并用NaCl将培养体系中的Na+调节至0.20mol/L,用1mol/L的HCl溶液将pH值调节为7.5后,接种5mL活性污泥,加盖密封.采用相同操作,利用基础培养基构建以H2/CO2为碳源的培养体系.其中,每只血清瓶的培养基分装剂量为 50mL,污泥接种量 2.5mL.加盖密封前,用 H2/CO2(v/v=80/20)的混合气吹脱5min.

所有培养体系构建完成后,置于 37℃、150r/min的空气浴恒温摇床中培养.以乙酸盐为碳源的培养体系,依照[HCO3–]依次编号为 A0、A0.05、A0.1、A0.15和A0.2,以H2/CO2为碳源的培养体系依次编号为H0、H0.05、H0.1、H0.15和H0.2.

培养过程中,对于以乙酸为碳源的培养体系,每2d测定一次产气量和气体组分,同时检测液相的pH值和乙酸浓度;对于以H2/CO2为碳源的培养体系,每12h测定一次气体组分,每24h测定一次pH值.

1.4 检测方法

pH值、碱度(ALK,以CaCO3计)、MLSS和MLVSS的检测依照标准方法进行[16].其中,pH值检测采用DELTA320型pH计(Mettler Toledo),生物量(MLSS和MLVSS)测定采用恒重法.气体产量采用气压平衡法,以20mL玻璃注射器测量,并折算为标准状态(0°C,101.325kPa)下的体积.气相组分(H2和CH4)和液相中的挥发性脂肪酸(VFAs)分别采用SP6800A型(TCD检测器)和SP6890型(FID检测器)气相色谱仪(山东鲁南瑞虹化工仪器有限公司)检测[14].

1.5 产甲烷菌群落结构分析

取培养前后的活性污泥进行产甲烷菌群落结构分析.采用PowerSoil DNA试剂盒(Mo-Bio Laboratories Inc., CA, USA)提取活性污泥的基因组DNA,克隆文库的构建及T-RFLP分析参照文献进行[17].其中,T-RFLP所用的限制性内切酶为HaeⅢ,PCR所用引物为古细菌通用引物,即: ARC8F(5′-YCYGKTTGATCCYGSCRG-3′) 和ARC931R(5′-CCCGCCAATTCCTTTHAG-3′).

1.6 数据分析

气相中的H2和CH4体积百分数、液相的乙酸浓度和pH值等数据,均取3个平行培养体系的平均值.采用改进后的 Gompertz模型[式(1)],对单位底物的甲烷累积产量(M(t),mmolCH4/mmol底物)进行非线性拟合,并从中求得底物的理论甲烷产量(Pmax,mmolCH4/mmol底物)、最大产甲烷速率[Rmax,mmolCH4/(mmol底物∙d)]和停滞期时间(λ,d)[18].

2 结果与分析

2.1 HCO3–影响下的H2/CO2产甲烷特征

如图1a,在培养的前2.5d,不加HCO3–的厌氧活性污泥培养体系(H0),其H2转化速率明显高于投加了 HCO3–的培养体系(H0.05、H0.1、H0.15和H0.2).H0气相中的H2,由初始的34.2mmol/L降低到第2.5d的25.2mmol/L,而此后则表现出较其他培养体系更低的H2转化速率.

随着 H2的消耗,发酵体系的 M(t)不断增加.如图1b所示,在培养初期,H0的M(t)明显高于投加了HCO3–的培养体系,但自2.5d以后,其M(t)增加缓慢,且明显低于另外4组投加了HCO3–的培养体系.至第6d培养结束时,H0.05、H0.1、H0.15和 H0.2利用 H2/CO2的 M(t)分别平均为 0.21、0.21、0.24和 0.24mmolCH4/mmolH2,均高于 H0的0.20mmolCH4/mmolH2.可见,一定浓度的HCO3–对厌氧活性污泥中的 HM活性具有明显的刺激作用.由于培养体系的底物为乙酸或 H2/CO2,甲烷发酵过程表现为产碱发酵[19].但各培养体系的pH值在培养过程中的变化均不显著(图1c),说明各系统均具有良好的酸碱缓冲能力[20].

图1 厌氧活性污泥利用H2/CO2的产甲烷特征Fig.1 Performance of anaerobic activated sludge in methane production from H2/CO2

2.2 HCO3–影响下的乙酸产甲烷特征

如图2a所示,以乙酸为惟一碳源的所有培养体系中,乙酸含量在培养初期均有所升高,其原因可能是部分活性污泥微生物无法适应新环境而死亡,其细胞融解所释放的有机物在产酸发酵菌群的作用下产生了乙酸[21].未添加 HCO3–的 A0,在 21d内可将乙酸完全转化,乙酸降解速率显著高于另外 4组投加 HCO3–的培养体系(A0.05、A0.1、A0.15和A0.2).随着[HCO3–]提高,A0.05、A0.1、A0.15和A0.2的λ依次延长,在对数期表现出的最大乙酸降解速率依次降低,表明过高的[HCO3–]会抑制乙酸的产甲烷作用.值得关注的是,所有以乙酸为惟一碳源的培养体系表现出了一个共同特征,即:当体系的乙酸浓度降低到5mmol/L以下时,厌氧活性污泥对乙酸的降解速率明显降低,这可能与不同种属的AM所适宜的乙酸浓度存在差异有关[22].

图2 厌氧活性污泥利用乙酸的产甲烷特征Fig.2 Performance of anaerobic activated sludge in methane production from acetate

随着乙酸的消耗,培养体系的 M(t)不断增加.由图2b可知,A0的M(t)增加最快,在第21d时达到峰值.[HCO3–]为0.05和0.1mol/L的培养体系,与未投加HCO3–的A0相比,其停滞期明显延长,其M(t)也明显降低,但最终的M(t)与A0的相当.在[HCO3–]为0.15和0.2mol/L时,活性污泥代谢的停滞期更长,其最终M(t)明显低于A0、A0.05和A0.1.以上结果表明,在0.05～0.2mol/L的范围内,[HCO3–]越高,对嗜乙酸产甲烷作用的抑制程度越高.

[HCO3–]的提高可显著提升系统对pH值变化的缓冲能力.如图 2c所示,在[HCO3–]≥0.05mol/L的培养体系中,其发酵过程的 pH值并无显著变化,而未添加HCO3–的A0,其pH值则有显著升高.

2.3 HCO3–对产甲烷菌群落结构的影响

如图3a所示,在作为接种物的厌氧活性污泥中,检测出4种丰度显著的产甲烷菌,包括79.2%的产甲烷杆菌(Methanobacterium formicium)、2.4%的产甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、11.0%的产甲烷丝状菌(Methanosaeta concilii)和7.3% 的 产 甲 烷 丝 状 菌 (Methanosaeta harundinacea).其中,M. formicium为专性HM,M. concilii和 M. harundinacea为专性 AM,而 M.mazei即可利用乙酸也可利用H2/CO2产甲烷.以H2/CO2为惟一碳源进行培养时,无论是否添加HCO3–,活性污泥中 M. formicium的丰度均保持在 70%以上.而接种污泥中的 M. mazei、M. concilii和M. harundinacea等优势菌群,在不添加HCO3–的条件下(H0)培养后则不能检出.在[HCO3–]分别为0.05和0.1mol/L条件下培养后的活性污泥中,除了能检测到 M. formicium 和 M. harundinacea外,还能够检测到未知古细菌198bp.当[HCO3–]≥0.15mol/L时,培养后污泥中的 M. formicium丰度较[HCO3–]≤0.1mol/L的培养体系有显著降低,而未知古菌58bp则大量增加.

研究表明,M. formicium没有细胞色素,能够利用低浓度的H2较快生长,而M. mazei具有细胞色素,无法在氢分压(PH2)较低的环境中生存[23].图 1a的结果显示,随着培养时间的延续,各系统气相中的H2浓度均呈现迅速下降趋势,培养结束时几乎消耗殆尽.如图 3a所示,在[HCO3–]≥0.15mol/L的以H2/CO2为惟一碳源的培养体系中,培养前后均能检测到 M. mazei的存在.但[HCO3–]≤0.1mol/L时,在培养后的活性污泥中无法检测到 M. mazei.可见,[HCO3–]的提高,有利于M. mazei在低PH2下的生长.[HCO3–]分别为0.05、0.1和0.15mol/L的培养体系,其pH值均维持在7.4～7.8(图 1c),恰是 M. formicicum生长的最适pH[24-25].因此,这3个培养体系表现出了较其他以H2/CO2为碳源的培养体系更高的Rmax(表1).

以乙酸为惟一碳源时,在培养后的活性污泥中,除了M. formicium、M. mazei、M. concilii和M. harundinacea等优势菌群外,还检测到了未知的 58bp、80bp和 198bp等古细菌(图 3b).随着[HCO3–]的提高,活性污泥中M. formicium丰度随之升高,而 M. harundinacea丰度保持稳定,M. concilii丰度则有所降低.在[HCO3–]≤0.1mol/L的培养体系中,其M. mazei丰度没有显著差异.然而,当[HCO3–]依次提高为0.15和0.2mol/L时,培养后活性污泥中的 M. mazei丰度随之降低. Methanosarcina和Methanosaeta虽同属AM,但在生理生态和生理生化习性上存在较大差异. Methanosarcina能够生成具有保护作用的荚膜,可以适应恶劣的生存环境,而Methanosaeta对环境变化较敏感[26].研究发现,M. concilii和 M. harundinacea生长的适宜 pH 值范围分别是7.1～7.5和7.2～7.6,而M. mazei的适宜pH值范围较广,为4.0～9.0[27-28].如图2c所示,在以乙酸为惟一碳源的培养体系中,其pH值均保持在8.0以上的水平,对 Methanosaeta的生长是不利的,而对M. mazei是比较适宜的.因此,经过培养,活性污泥中M. concilii和M. harundinacea的丰度显著降低,而M. mazei的丰度变化并不明显.

图3 以H2/CO2(a)或乙酸(b)为碳源培养的厌氧活性污泥的优势菌群相对丰度Fig.3 Relative abundance of dominant microbial communities in anaerobic activated sludge after been cultured with H2/CO2(a) or acetate (b) as carbon source

Methanosarcina和 Methanosaeta在增殖和乙酸利用能力上也存在差异.Methanosarcina利用乙酸激酶-磷酸转乙酰酶将乙酸转化为乙酰CoA,但只有在乙酸浓度达到1mmol/L以上时才能发生,最大比生长速率(μmax)可达0.06h-1[22,29-30].而Methanosaeta利用乙酰CoA合成酶合成乙酰CoA,只能利用低浓度的乙酸,当乙酸浓度大于20µmol/L时,嗜乙酸产甲烷反应就会受到抑制, μmax只有0.032h-1[30-31].因此,在图2a中可以观察到,当培养体系中的乙酸浓度降低到5mmol/L以下后,活性污泥利用乙酸的速率明显降低.

乙酸的甲烷转化包括 2种代谢途径:一是AM 分解乙酸生成甲烷;二是互营乙酸氧化菌(SAOB)将乙酸分解为H2/CO2,而后再被HM利用而生成甲烷[32].所以,以乙酸为惟一碳源培养时,在活性污泥中仍能检测到大量的嗜氢产甲烷菌M. formicicum(图3b).如前所述,HM较AM有更加宽泛的生长 pH值,当 pH值达到 8.0以上时,AM 就会受到抑制,系统中的乙酸将主要被SAOB和HM利用并产生甲烷[33].可见,HCO3–可以通过改变或维持系统的pH值对厌氧活性污泥的产甲烷特性产生影响.Lin等[34]在研究葡萄糖高温甲烷发酵中也发现,高水平的[HCO3–]能抑制Methanosaeta的生长,却可促进HM的生长.

2.4 甲烷发酵的动力学分析

以式(1)对测得的单位底物的 M(t)进行非线性拟合,求得厌氧活性污泥在不同[HCO3–]下的Pmax、Rmax和λ.如表1所示,在以H2/CO2为碳源时(表1),[HCO3–]为0.15mol/L的培养体系H0.15,其Rmax显著高于其余4组,其Pmax虽略低于H0.2,但明显高于H0、H0.05和H0.1.比较而言,[HCO3–]为 0.1mol/L的培养体系 H0.1其 λ最短,为2.616d.当[HCO3–]继续升高时,培养体系的λ显著延长,说明产甲烷菌群在[HCO3–]≥0.15mol/L条件下,需要较长的调整适应期.

对于以乙酸为碳源的培养体系(表2),未添加HCO3–的培养体系A0,其λ(7.305d)显著低于添加了 HCO3–的培养体系(≥16.97d),其 Rmax[0.053mmolCH4/(mmol乙酸∙d)]则显著高于添加了HCO3–的培养体系[≤0.023mmolCH4/ (mmol乙酸∙d)].这一结果表明,随着[HCO3–]的提高,乙酸的Pmax增加,但Rmax随之降低,且λ延长.因此,要使厌氧活性污泥中的AM维持良好的代谢活性,需要将反应系统的[HCO3–]维持在 0.05mol/L以下的水平.

表1 厌氧活性污泥以H2/CO2为碳源的甲烷发酵动力学特征参数Table 1 Methane fermentation kinetic parameters of anaerobic activated sludge with H2/CO2as carbon source

表2 厌氧活性污泥以乙酸为碳源的甲烷发酵动力学特征参数Table 2 Methane fermentation kinetic parameters of anaerobic activated sludge with acetate as carbon source

2.5 甲烷发酵的热力学分析

在厌氧消化系统中,AM 在利用乙酸产甲烷时也会生成HCO3–[式(2)].而HM可以H2作为电子供体,将HCO3–还原为甲烷[式(3)].可见,向甲烷发酵系统投加HCO3–可以刺激 HM的产甲烷反应,同时也可能抑制AM的产甲烷作用.

如式(2)和式(3)所述的反应,其实际吉布斯自由能变化(ΔG)受底物和产物浓度影响[35].对于一般反应a[A] + b[B] = c[C] + d[D],可利用式(4)计算不同[HCO3–]下的ΔG,即

式中:R为常数,8.29J/(mol∙K);T是绝对温度,K.

图4 产甲烷反应的吉布斯自由能变化Fig.4 Change in Gibbs free energy for methanogenic reaction

由式(4)对以H2/CO2或乙酸为惟一碳源的厌氧活性污泥系统的产甲烷反应 ΔG分别计算,结果如图4所示.在以H2/CO2为惟一碳源的甲烷发酵体系中(图4a),ΔG随PH2的降低而增加.在无外加HCO3–的体系中,其ΔG最高.HCO3–的添加,则可减少嗜氢产甲烷反应的 ΔG,且 HCO3–剂量越高,ΔG减少的幅度越大.如表1所示的结果显示,随着[HCO3–]的提高,以 H2/CO2为碳源的培养体系的 Rmax也随之增加.可见,提高系统的[HCO3–]能够降低嗜氢产甲烷反应的 ΔG,进而促进活性污泥的嗜氢产甲烷活性.对于以乙酸为惟一碳源的培养体系(图4b),随着乙酸浓度的降低,其产甲烷反应的 ΔG随之升高,而 HCO3–的添加则显著提高了ΔG.也就是说,提高[HCO3–]对嗜乙酸产甲烷反应具有抑制效应.

4 结论

4.1 [HCO3–]可改变甲烷发酵系统的群落结构与代谢活性,进而影响系统的产甲烷效能.以H2/CO2为惟一碳源时,[HCO3–]的增加可提高厌氧活性污泥中M. mazei和M. concilii的数量,而以乙酸为惟一碳源时,提高[HCO3–]能够增加 M. formicium的数量.

4.2 0.15～0.20mol/L的[HCO3–]可有效降低嗜氢产甲烷反应的ΔG,刺激嗜氢产甲烷菌的代谢活性.

4.3 [HCO3–]的升高,会提高嗜乙酸产甲烷反应的ΔG,对嗜乙酸产甲烷菌活性具有显著抑制作用.

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Mechanisms of bicarbonate's effect on hydrogenotrophic and aceticlastic methanogens.

ZHANG Yu-peng1, LI Jian-zheng1*, LIU Feng-qin1, LIU Chong1,2, SHI En1(1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China；2.The 101 Research Institute of the Ministry of Civil Affairs, Beijing 100070, China). China Environmental Science, 2017,37(5)：1937～1944

Effect of bicarbonate concentration ([HCO3–]) on hydrogenotrophic methanogens (HM) and aceticlastic methanogens (AM) in anaerobic activated sludge was investigated with H2/CO2and acetate as the sole carbon source, respectively. The mechanisms of bicarbonate's effect on methane formation was analysed based on the methane production efficiency, community structure of methanogens, reaction kinetics and thermodynamics. The results showed that [HCO3–] ranged from 0.05 to 0.20 mol/L could stimulate the activity of HM, and the higher hydrogen partial pressure, the lower [HCO3–] for the stimulation. An increased [HCO3–], on the contrary, would inhibit the methanogenesis of AM. Methanobacterium formicium and Methanosarcina mazei were identified as the dominated HM and AM, respectively, in the incubated anaerobic active sludge. It was found that the abundance of M. formicicum was enhanced by the increased [HCO3–] in the fermentation systems. The abundance of M. mazei was also improved by a [HCO3–] less than 0.10mol/L, but decreased with the [HCO3–] over than 0.15mol/L. Variation of [HCO3–] could significantly change the pH and Gibbs free energy of the methanogenic reactions in the fermentation processes, and the methanogenesis activities of HM and AM were further affected as a result.

anaerobic activated sludge；bicarbonate；methanogenesis；hydrogenotrophic methanogen；aceticlastic methanogen

X172

A

1000-6923(2017)05-1937-08

张玉鹏(1988-),男,河南新乡人,哈尔滨工业大学博士研究生,主要研究方向为厌氧废水处理.

2016-10-08

国家自然科学基金资助项目(51478141);城市水资源与水环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学)自主课题(2016DX06)

* 责任作者, 教授, ljz6677@163.com