日粮添加苦荞提取物对绵羊背最长肌抗氧化性能的影响

金亚倩，赵俊星，苏 锐，辛晓斌，韩晓强，张文佳，项斌伟，张建新*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 2.山西省右玉县畜牧局，山西右玉 037200）

日粮添加苦荞提取物对绵羊背最长肌抗氧化性能的影响

金亚倩1，赵俊星1，苏 锐1，辛晓斌1，韩晓强1，张文佳2，项斌伟2，张建新1*

（1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801; 2.山西省右玉县畜牧局，山西右玉 037200）

苦荞含有多种有益健康的成分，其中苦荞黄酮具有较强的抗氧化性。本试验旨在研究日粮中添加苦荞提取物对绵羊背最长肌（LD）抗氧化性的影响。试验选取24只5月龄、体重（25±0.5）kg杜泊×小尾寒羊杂一代母羊，采用完全随机设计平均分为4组（对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组），分别饲喂含有不同苦荞提取物添加量（0、1、5、20 g/kg）的日粮。试验期80 d。试验结束后，屠宰取样，测定试验羊LD组织抗氧化性能。结果表明：试验Ⅰ组LD组织的总抗氧化能力（T-AOC）极显著高于对照组（P＜0.01），试验Ⅲ组谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性显著升高（P＜0.05），丙二醛（MDA）含量显著降低（P＜0.05）；与对照组相比，试验Ⅱ组Cu-ZnSOD mRNA与蛋白表达量显著升高（P＜0.05，P＜0.01），试验Ⅰ组GPx4蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。综上可得，日粮中添加苦荞提取物能够改善绵羊LD抗氧化性能。

苦荞提取物；羔羊；背最长肌；抗氧化性

苦荞，学名鞑靼荞麦，蓼科荞麦属，在我国栽培历史悠久，分布广泛，种植面积与产量居世界第一位。据报道，苦荞拥有健康功效，包括降血糖、降血脂、降血压、降胆固醇、抗肿瘤、抗疲劳等[1]，以苦荞为原料开发的各种食品、保健品越来越受到人们的青睐。黄酮类化合物在苦荞中的含量极为丰富，广泛存在于苦荞的茎、叶、花、籽粒等各个部位，是苦荞发挥各种生物学功效的主要成分[2]。抗氧化作用是苦荞黄酮拥有的生理活性之一。研究表明，苦荞叶、苦荞壳以及苦荞麸皮等的提取物都有显著的抗氧化能力[3]。Li等[4]研究发现，苦荞提取物能够在体外细胞培养中发挥抗氧化作用。李富华等[5]研究证明，苦荞麸皮黄酮具有一定程度的抗氧化性，且表现出了时效关系。目前对苦荞黄酮抗氧化性能的研究主要集中于体外或模式生物上，而关于苦荞黄酮与绵羊肌肉抗氧化性的关系尚未见报道。本试验以杜泊×小尾寒羊杂一代母羊为对象，旨在研究日粮中添加苦荞提取物对绵羊肌肉抗氧化性的影响，为苦荞加工副产品在肉羊生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及动物饲养 试验选用体重（25±0.5）kg的杜泊×小尾寒羊杂一代母羊24只（试验前均经过严格检疫），采用完全随机试验设计，将试验羊随机分为4组，每组6只，其中对照组饲喂基础日粮，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂在基础日粮中添加1、5、20 g/kg苦荞提取物（含40%黄酮）的试验日粮。基础日粮参照NRC（2007）绵羊营养需要设计配方。试验日粮配方及营养成分如表1。

试验于2015年5月至8月在山西省右玉县宏宇牧业有限公司种羊养殖场进行。预试期为10 d，正试期为80 d。试验开始前，试验羊舍进行全面清扫消毒，并对所有试验绵羊进行免疫注射羊痘、口蹄疫和小反刍兽疫疫苗。预试期间进行试验羊的分组、编号及驱虫工作。正试期内，试验羊每日分2次（08:00、18:00）饲喂，各组羊饲喂相对应的日粮。所有试验羊自由采食，自由饮水，准确记录每组羊每天的采食情况。

表1 试验日粮组成及营养成分表

1.2 试验试剂及抗体 苦荞提取物（苦荞黄酮含量为40.18%）购自陕西森弗高科实业有限公司；总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化物酶（CAT）、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa公司；Goat-Cu/ZnSOD多克隆一抗（sc-8637）、Goat-Catalase多克隆一抗（sc-34281）、Rabbit-GPx4多克隆一抗（sc50497）购自Santa Cruz Biotechnology公司，β-Tubulin Antibody购自Cell Signaling Technology公司，Donkey Antigoat IgG-HRP（sc-2020）二抗和Donkey Antirabbit IgG-HRP（sc-2313）二抗购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 样品的采集 在试验结束当天16:00，对所有试验羊禁食、禁水16 h，并在次日08:00进行屠宰。屠宰后，迅速采集试验羊只的背最长肌样品，用锡纸包裹并标记后放入液氮速冻，-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4 测定指标

1.4.1 背最长肌抗氧化能力测定 样品预处理：取在-80℃保存的背最长肌样品，在液氮中充分研磨至粉末，称取组织粉末1 g左右，按1:9的比例加入冰冷生理盐水，用组织匀浆仪匀浆5～10 min，制成10%的组织匀浆。将制好的匀浆4℃、3 500 r/min离心10 min，取上清进行下一步检测。

背最长肌组织上清T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA水平等指标测定按照南京建成提供的试剂盒说明书操作。

1.4.2 荧光定量PCR 背最长肌样品在液氮中迅速研磨，按照Trizol Reagent试剂盒的操作说明提取组织总RNA，并合成cDNA。按TaKaRa公司的SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书，进行实时荧光定量PCR反应。扩增条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃ 退火延伸34 s，共45个循环；95℃ 15 s ；60℃ 1 min；95℃ 15 s。引物信息列于表2。

表2 各基因引物序列

1.4.3 Western blot分析 称取0.1 g研磨好肌肉样品，加入裂解液进行蛋白样品的制备，经匀浆、沸水浴、超声波破碎、离心10 min后取上清，4℃保存备用。配制10%分离胶与4%浓缩胶，进行SDSPAGE电泳。电压100 V转膜1～1.5 h，封闭1 h，一抗（1:1000）孵育4℃过夜，二抗室温孵育1.5 h，曝光成像。

1.5 统计分析 试验数据用Excel 2013进行初步整理，然后运用SPSS 22.0进行单因素方差分析，并用Dunnett法分析比较各试验组与对照组之间数据的差异显著性，以P＜0.05和P＜0.01为差异显著和极显著性判断标准，结果以平均值±标准误的形式表示。

2 结 果

2.1 日粮添加苦荞提取物对绵羊背最长肌抗氧化能力的影响 从表3中可以看出，试验Ⅰ组与对照组相比，绵羊背最长肌T-AOC极显著提高（P＜0.01），试验Ⅱ组与试验Ⅲ组均较对照组有增加的趋势。苦荞提取物可降低试验绵羊背最长肌中MDA含量，其中试验Ⅲ组MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）。试验Ⅲ组绵羊背最长肌中GSH-Px的活性显著高于对照组（P＜0.05）。试验组绵羊背最长肌中SOD及CAT活性较对照组均无显著差异（P＞0.05）。

表 3 苦荞提取物对绵羊背最长肌抗氧化性的影响

2.2 日粮添加苦荞提取物对绵羊背最长肌Cu-ZnSOD、GPx4与CAT基因表达量的影响 如图1所示，与对照组相比，日粮中添加苦荞提取物提高了试验Ⅱ组绵羊Cu-ZnSOD基因的表达量（P＜0.05），试验Ⅰ组与试验Ⅲ组同样有升高的趋势。GPx4与CAT基因mRNA相对表达量与对照组相比无显著差异（P＞0.05）。

2.3 日粮添加苦荞提取物对绵羊背最长肌Cu-ZnSOD、GPx4与CAT蛋白表达量的影响 如图2所示，苦荞提取物可提高绵羊背最长肌中Cu-ZnSOD蛋白相对表达量，其中试验Ⅱ组Cu-ZnSOD蛋白相对表达量最高，极显著高于对照组（P＜0.01）。背最长肌中GPx4蛋白相对表达量也受到日粮中苦荞提取物的影响，其中试验Ⅰ组与对照组相比，GPx4蛋白的表达量显著提高（P＜0.05），试验Ⅱ组也表现出了同样的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。添加苦荞提取物后，CAT蛋白的相对表达量与对照组相比没有显著差异（P＞0.05）。

3 讨 论

羊肉作为一种优质畜肉，具有肉质鲜嫩、脂肪和胆固醇含量少等特点，有着较高的营养价值和很好的食疗效果，加之其食用没有宗教、文化的禁忌，因此越来越受到人们的青睐。

图1 Cu-ZnSOD、GPx4、CAT基因mRNA相对表达量

动物经屠宰后，肉质通常会发生一系列变化。正常情况下，机体会不断产生多种抗氧化物质（如SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶），不断清除体内过剩自由基，生物体自由基代谢处于一种平衡状态，各组织细胞不会受到自由基的损害。畜禽在屠宰后，自由基代谢平衡被破坏，过量的自由基会攻击肌肉细胞中的不饱和脂肪酸和蛋白质。此时，机体已不再产生新的抗氧化物质，主要依靠肌肉组织中已有的抗氧化酶防御自由基攻击，保护肌肉细胞不被破坏，肌肉组织处于强烈的氧化应激状态，从而导致肌肉蛋白质变性、脂质过氧化和酸败[6]。在肉类的储存过程中，脂质的过氧化是影响肉品质的一个重要因素，它可以导致肉质颜色变差、滴水损失增加、有毒有害物质积累，大大地降低了肉的食用性和商品价值[7]。多年以来，人们在肉产品加工与保存过程中常添加丁羟甲苯、特丁基对苯二酚等人工合成的抗氧化剂来延长肉产品货架期[8]，但是，这些化学抗氧化剂具有一定毒副和致癌作用，严重影响到人类健康。有研究称，在肉产品加工过程中添加一些天然抗氧化剂，如多酚提取物，可以有效提高产品抗氧化能力[9]。也有研究表明，在动物日粮中添加部分抗氧化剂可以使这种抗氧化能力随循环系统分布于各组织，有利于动物健康，同时减缓宰后肉脂质过氧化反应，较长时间保持肉的稳定性[10]。

图2 Cu-ZnSOD、GPx4、CAT蛋白相对表达量

随着研究的深入，以含抗氧化活性成分的植物饲喂动物成为延长畜禽肉产品货架期、提高其感官和食用品质的有效途径。陈志辉等[11]在肉鸡饲料中添加女贞子原粉有效提高了鸡肉抗氧化酶活性和总抗氧化水平，同时检测到GPx4基因的相对表达量显著提高。Qwele等[12]研究表明，以辣木树叶（含多酚类化合物）代替部分粗饲料饲喂山羊可以显著提高山羊肌肉中SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性，肉色和不饱和脂肪酸的含量也有所改善。

苦荞是一种药食同源作物，其药用价值主要体现在黄酮类化合物。苦荞黄酮具有多样、复杂的生物学活性[13]，其包含的主要生物类黄酮成分有槲皮素、芦丁、荭草苷、异荭草苷、牡荆碱、异牡荆碱等，其中含量最多的是芦丁（Rutin），达到苦荞中总黄酮含量的70%～85%[14]。刘金玉[15]研究发现，苦荞芦丁可以明显抑制猪脂肪的氧化，且随着芦丁浓度的增加抑制效果会逐渐增强。此外，苦荞芦丁也表现出对·OH、O2-较强的清除能力。 Lee等[16]通过亚铁还原能力实验（FRAP）、DPPH自由基清除法和ABTS自由基清除法确定了苦荞中黄酮类化合物的抗氧化能力，而且证实了芦丁在苦荞抗氧化过程中发挥着主要作用。

组织总抗氧化能力（T-AOC）是反映组织抗氧化水平最直观的指标；抗氧化酶活性对减轻组织氧化应激，抵抗脂质过氧化反应具有重要意义，也是反映组织抗氧化能力的一个重要指标。MDA作为氧化应激反应的终产物之一，其含量能够有效反映组织遭受氧化应激的程度。在本研究中，添加苦荞提取物后绵羊背最长肌T-AOC显著提高，GSHPx的活性升高，同时，肌肉中脂质过氧化产物MDA含量显著降低。这一结果说明，肌肉抗氧化水平在添加苦荞提取物后有所提高，可能是苦荞提取物中的黄酮类化合物起到了关键性作用，它的摄入在一定程度上增强了绵羊机体的抗氧化能力。

抗氧化酶活性的提高是否与其表达量增加有关，本试验做了进一步研究。从抗氧化相关基因在背最长肌中的相对表达量来看，摄入苦荞提取物后，5%添加组绵羊Cu-ZnSOD基因mRNA相对表达量显著升高，且与Western blot得到的结果一致，这说明苦荞提取物的摄入可能在基因转录和翻译水平同时影响了Cu-ZnSOD基因的表达。推测可能是因为蛋白的翻译与表达开始于mRNA的转录，mRNA表达量的提高促进了蛋白表达量的升高，这样的结果说明苦荞提取物的摄入影响到了Cu-ZnSOD基因mRNA的转录水平，进而促进了蛋白的合成。然而，GPx4基因的mRNA相对表达量各组间均无差异，但其在5%苦荞提取物添加水平下蛋白的表达量却显著升高。这种mRNA表达量与其蛋白表达不一致的情况，可能是由于苦荞黄酮对绵羊肌肉中GPx4基因的翻译过程起到了促进的作用，但没有对其转录水平造成影响，但具体的作用机制尚不清楚，需要进一步研究。

4 结 论

本试验结果表明，绵羊日粮中添加苦荞提取物后，可以明显改善绵羊背最长肌的抗氧化能力，这将为苦荞在畜牧生产中的广泛应用提供一定的理论依据。饲喂苦荞提取物可能在一定程度上对绵羊的肉质产生有利的影响，但需要进一步的试验验证。

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S826.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-05-108

2016-06-07；

2016-11-20

国家现代肉羊技术体系专项（CARS-39）

金亚倩（1990-），女，山西曲沃人，硕士，主要从事动物繁殖生物技术研究，E-mail：jinyq2009@163.com

* 通讯作者：张建新，教授，博士生导师，主要从事饲料资源开发与利用研究，E-mail：ypzjx@126.com