19F-NMR定量检测1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯的参数优化

李 腾 黄桂兰 袁 铃 周世坤 张 何

(防化研究院，北京 102205)

19F-NMR定量检测1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯的参数优化

李 腾 黄桂兰*袁 铃 周世坤 张 何

(防化研究院，北京 102205)

建立了核磁共振氟谱法测定氰化物的氟化衍生化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-苯乙基乙酸酯(CTPA)含量的方法。以乙酸3-氟苄酯为内标，采用5mm Auto XBB探头，探头温度298.2K，考察了不同浓度化合物的定量条件；通过比较化合物样品定量峰与内标物质响应峰面积，计算化合物的含量。结果该化合物的19F-NMR检测方法在0.5～50μg/mL具有良好的线性(r2=0.9966)，该方法的定量限0.5 μg/mL，检出限0.2 μg/mL；同时考察了该化合物在不同浓度下的测量准确度。

核磁共振19F-NMR 1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯 定量 含量

1 引言

氰化物[1，2]是分子中含有氰根(-CN)的化合物，分为无机氰化物和有机氰化物，本文所指的氰化物主要是无机氰化物，如氰化钠、氰化钾。尽管该类化合物毒性较强，却是黄金生产、电镀、矿业、金属制造业等化工行业的重要原料，作为化学毒剂[3]曾在战争中使用过的有氯化氰(ClCN)和氢氰酸(HCN)两种，这是将这两种化合物列入附表3化学品的主要原因。根据禁止化学武器组织(OPCW)[4，5]的要求，对于附表化学品及其相关化合物的准确鉴定必须采用至少两种技术(其中至少一种为波谱技术)来鉴定并给出一致的结果。波谱技术主要包括气相色谱-电子轰击质谱(GC-EI/MS)、气相色谱-化学电离-串联质谱(GC-MS/MS(CI))、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)、核磁共振波谱(NMR)和红外光谱(IR)。对于ClCN而言，可以通过GC/MS直接进行检测；HCN则仅可用顶空GC/MS进行检测。NMR[6]作为一种波谱技术，在OPCW官方效能水平考试(简称水平考试)中得到成功应用，但是由于13C和15N核的自然丰度和磁比率低，氰化物只有在高浓度下采用13C-NMR和15N-NMR检测。原子核F的自然丰度高，19F核的绝对敏感度是质子的0.83倍，并且谱图有尖的洛伦茨线型和宽的化学位移，19F-NMR[7]可以满足对低浓度化合物的检测；要实现1 mg/mL(或g/kg)ClCN和HCN的NMR分析，可借助氟化物衍生，将其转化为含氟化合物，采用氟谱(19F-NMR)实现化合物的间接鉴定。本实验以氰化钠、三氟苯乙酮、乙酸酐为原料，合成了化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)，作为氰化物氟化衍生产物的标样。

衍生反应过程如图1[8]所示：

图1 用三氟苯乙酮衍生氰根示意图

首先CN-与三氟苯乙酮发生亲核加成反应生成活性中间体1-氰基-2,2,2-三氟-1-苯基乙醇碱，然后进一步与酸酐发生酯化反应得到稳定衍生物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)。

为了使用19F-NMR准确定量检测氰根的氟化衍生物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯，从而准确定量氰根的含量；本实验以乙酸3-氟苄酯为内标，使用Varian NMR System 600超导核磁共振波谱仪考察及优化了不同浓度下1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯的定量条件[9，10]。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Varian NMR System 600超导核磁共振波谱仪(美国Varian公司)，600MHz 5 mm脉冲梯度场双通道宽带多核共振探头，工作站软件VnmrJ 2.1B和VnmrJ4.0。

氘代氯仿(CDCl3，99.8%氘代度，含0.03% TMS，CIL公司)；重水(D2O，99.8%氘代度，含0.03% TMS，CIL公司)；乙酸3-氟苄酯(97%分析纯，百灵威)；1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA，自己合成，结构通过1H-NMR，13C-NMR，19F-NMR，GC-MS，LC-MS鉴定，19F-NMR检测纯度为97%)。

2.2 仪器检测条件

19F-NMR检测条件：19F核共振频率：564 MHz；谱宽sw=131578.9Hz；射频中心位置：tof= 14819.6Hz;射频功率：tpwr=61dB; 90度脉冲宽度：pw90=14.75ms；采样时间：at=0.966ms；采样点：np=262144；滤波带宽：fb=47800；接收机增益：gain=54; 检测温度：25°C。

2.3 样品配制

称取化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)2.9 mg，使用CDCl3配成1 mg/mL溶液作为标准使用液，逐级稀释为500、250、100、50、10 μg/mL；称取内标乙酸3-氟苄酯3.1 mg，使用CDCl3配成1 mg/mL溶液作为标准使用液，逐级稀释为500、250、100、50、10 μg/mL。

3 结果与讨论

3.1 内标的选择

内标[10]的选择主要考虑以下几个方面：(1)内标物应具有较高的纯度且获得准确定值；(2)与被测物质的化学性质相近；(3)化学性质稳定；(4)不与样品中的物质发生反应；(5)吸收峰与待测化合物的特征峰之间应避免干扰；(6)非挥发性化合物，不易吸潮；(7)具有合适的T1，最好与待测物目标峰的纵向弛豫时间相近。乙酸3-氟苄酯具有化学性质较稳定，不与化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)发生反应，并且氟谱吸收峰明显分开等特点。本实验选择乙酸3-氟苄酯作为定量检测内标。

3.2 弛豫时间(d1)与脉冲宽度(pw)对定量准确度的影响

定量核磁中要求弛豫延迟时间(d1)足够长使所有核子充分弛豫，核磁共振定量方法参数设定中，首先要考察d1值是否合理。因此考察了以乙酸3-氟苄酯为内标时，不同弛豫时间对化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)定量结果的影响。

3.2.1 T1值的测定

纵向弛豫时间(T1)反映原子核把能量传给周围核所需时间，也是原子核自旋系统恢复到平衡状态的一个特征；弛豫延迟时间(d1)的选择受化合物纵向弛豫时间(T1)值的影响，一般选择T1值较大的化合物的T1值的倍数作为弛豫时间。考虑到化合物的检测浓度有高有低，浓度高低会影响影响化合物的T1值，因此测定了不同浓度下衍生化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯的T1值。结果见表1、图2。

表1 不同浓度下衍生化合物(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯的T1值

图2 不同浓度下衍生化合物(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯的T1值

从图2不同浓度下衍生化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯的T1值变化，得出化合物的浓度越高，其纵向弛豫时

间T1值也越大；因此为了定量的准确性，使所有核子充分弛豫，选择较大的T1值用作参数设定，所以高浓度下的化合物的d1值也可以满足低浓度下化合物的d1值用于定量。

3.2.2 不同脉冲宽度(pw)和弛豫延迟时间(d1) 对定量准确度的影响

不同的脉冲宽度(pw)会影响到激发核的信号强度，因为不同样品的理化性质，不同的样品也会影响脉冲宽度的有效性。为了达到更好的精度和准确度，选择合适的脉冲宽度是必要的。

使用样品浓度都为250 μg/mL的1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯，增益gain=max(52)，去耦方式: 耦合-NOE，nt=4，选择较大T1值(乙酸3-氟苄酯的T1值，T1=5s)的倍数作为弛豫延迟时间，不同脉冲宽度(pw)下CTPA纯度测定结果见表2、图3。

表2 不同脉冲宽度(pw)和弛豫延迟时间(d1)下的CTPA纯度

图3 不同脉冲宽度(pw)和弛豫延迟时间(d1)下的CTPA纯度结果对比

以上数据给出，以乙酸3-氟苄酯为内标，测1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)的纯度在不同脉冲宽度(pw)下随d1的改变结果，当d1增大时，测定的1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)的纯度趋于稳定；当d1超过5T1时，再改变d1，所测1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)的纯度基本再无变化，因此实验以5T1作为d1值进行定量分析。

当化合物浓度低时，要长时间累加来达到要求的信噪比，信噪比越高，定量的准确度就越高；因此需要考虑通过降低弛豫延迟时间(d1)增加采样次数来达到较好的累加效率，使其信噪比达到最大；根据文献[11]给出不同的脉冲宽度、不同弛豫延迟时间与准确率误差的关系，为了使采样效率达到最高，选择准确率误差0.2%之内的参数条件对低浓度化合物(CTPA)定量条件进行考察，当pw=pw90，d1=1.8T1；当pw=pw75，d1=1.5T1；当pw=pw60，d1=1.3T1；当pw=pw45，d1=1T1；当pw=pw30，d1=0.5T1；检测准确率误差在0.2%之内，如图4所示。

图4 翻转角α与和最佳翻转角αB与最大弛豫时间之比(T/Tm)的依赖关系[11]

因此考察了浓度为10 μg/mL的1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯的

定量条件；低浓度的样品采集考虑到时间效率问题，设置采样时间30min，这5种条件下，C1(pw=pw90，d1=1.8T1)、C2(pw=pw75，d1=1.5T1)、C3(pw=pw60，d1=1.3T1)、C4(pw=pw45，d1=1T1)、C5(pw=pw30，d1=0.5T1)，增益gain=max(54)，去耦方式: 耦合-NOE，1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯信噪比的变化。结果如表3、图5。

图5 不同条件下3-FBA、CTPA信噪比的变化

化合物C1C2C3C4C5pw=pw90,d1=1.8T1nt=390pw=pw75,d1=1.5T1nt=450pw=pw60,d1=1.3T1nt=500pw=pw45,d1=1T1nt=600pw=pw30,d1=0.5T1nt=900CTPA21.10930.96620.82119.94918.297乙酸3-氟苄酯11.04014.39310.80910.2639.607

由图5数据得到，在条件2，脉冲宽度pw=pw75，弛豫时间d1=1.5T1，采样次数nt=450，autogain=max(54)的条件下，低浓度化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯采样信噪比均为最高。

因此综合考虑，在高浓度化合物采样时，为了使检测脉冲宽度结果更准确，采用脉冲宽度pw=pw75，弛豫延迟时间d1=5T1进行检测化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯；在低浓度采样时，为了在更有效的时间内所得化合物信噪比最高，采用脉冲宽度pw=pw75，弛豫延迟时间d1=1.5T1进行检测化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯。

3.3 化合物的定量限与检测限

本实验以信噪比S/N>10作为定量限的标准，以信噪比S/N>3作为检测限的标准。将1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)标准液逐级稀释为浓度100、50、25、15、10、5、1 μg/mL，以0.3 mL×100 μg/mL的乙酸3-氟苄酯为内标，采用实验条件脉冲宽度pw=pw75，弛豫时间d1=3s，接收增益gain=54，采样次数nt=64的相同采样条件(其中5μg/mL的nt=128，1μg/mL的nt=8000)；

手动调节相位和基线，进行手动积分，以峰面积比为纵坐标，浓度为横坐标，求得线性回归方程并计算得到r2值，结果见表4。由图6得到，定量曲线方程为y=3.09x-4.11，其r2=0.9966，该化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)的仪器方法的定量限为0.5μg/mL。当1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)浓度为0.2μg/mL时，脉冲宽度pw=pw75，弛豫时间d1=3s，采样次数nt=8000，1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)信噪比为6.023，符合检出要求，因此其检出限为0.2μg/mL。

图6 定量标准曲线

CTPA浓度峰面积比123平均值CTPA信噪比50μg/mL151.848151.292152.887152.00997.78325μg/mL73.85276.01772.61774.16244.75115μg/mL39.20638.56838.33038.70130.41510μg/mL23.84022.54023.17323.18419.1605μg/mL(nt=128)9.04910.23510.86310.04916.3001μg/mL(nt=8000)1.9961.8811.9871.95512.9710.5μg/mL(nt=8000)0.6880.7340.7260.71610.078

3.4 仪器准确度考察

随机取10～150μg/mL不同浓度的1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)溶液，以0.3mL×100μg/mL 乙酸3-氟苄酯为内标，准确测量其积分面积，再向不同浓度的1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)溶液加0.03mL×1mg/mL的标准溶液，测定其积分面积，计算回收率与相对标准偏差(RSD)，其结果见表5。

表5 不同浓度加标回收率

由表5得到，随机取10～150μg/mL 不同浓度的1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)溶液，以0.3mL×100μg/mL 乙酸3-氟苄酯为内标，加标测其峰面积，其相对标准偏差RSD值为5.05%。

4 结论

使用三氟苯乙酮将氰根衍生为含氟化何物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)，通过利用19F-NMR间接检测氰化物，通过试验优化了仪器方法参数建立了该衍生化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)在高浓度与低浓度条件下的定量核磁共振分析方法，在高浓度化合物采样时，采用脉冲宽度pw=pw75，弛豫延迟时间d1=5T1；在低浓度采样时，采用脉冲宽度pw=pw75，弛豫延迟时间d1=1.5T1进行检测化合物1-氰基-2,2,2-三氟-1-乙酸苯乙酯(CTPA)与内标乙酸3-氟苄酯，检测结果更加准确。并且利用优化的仪器条件，考察了该化合物的检测限为0.2μg/mL (S/N>3)、定量限为0.5μg/mL (S/N>10)以及不同浓度范围内的测量准确度，利用19F-NMR建立了该化合物的准确测定方法。

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Parameter optimization for19F-NMR quantitative detection of 1-cyano-2,2,2-trifluoro-1-phenylethylacetate.

Li Teng，Huang Guilan*，Yuan Ling，Zhou Shikun，Zhang He

(Research Institute of Chemical Defence，Beijing 102205，China)

This paper established a method for determination of 1-cyano-2,2,2-trifluoro-1-phenylethylacetate compound which was fluorinated derivative cyanide. Using acetic acid 3-fluoro-phenyl ester as the internal standard, the 5mm Auto XBB probe was adopted and the probe temperature was 298.5K. The quantitative conditions of the compounds in different concentrations were investigated. The compound content was calculated by comparing the peak area of the compound with the peak area of the internal standard substance. The result showed that the19F-NMR detection method had a good linearity (r2= 0.9966) in the range of 0.5-50μg/mL and the limit of quantification was 0.5μg/mL, the limit of detection was 0.2μg/mL. At same time the accuracy at different concentrations were also investigated.

nuclear magnetic resonance；19F-NMR；1-cyano-2,2,2-trifluoro-1-phenylethylacetate；quantitative； content

李腾，男，1993年出生，在读硕士研究生，主要研究方向核磁分析技术，E-mail：1546490279@qq.com。

黄桂兰，E-mail：hglhdm@163.com

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.014

2017-01-04