光动力疗法对尖锐湿疣皮损朗格汉斯细胞的影响

刘永鑫，郑和义

光动力疗法对尖锐湿疣皮损朗格汉斯细胞的影响

刘永鑫，郑和义

刘永鑫

目的观察光动力疗法（PDT）对尖锐湿疣（CA）患者皮损中朗格汉斯细胞（LC）的影响，进一步探寻PDT治疗CA的免疫机制。方法应用免疫组化标记方法，对15例PDT治疗前后的CA皮损及5例正常包皮组织对照进行染色，在高倍光镜下观察LC的形态、分布及数量等的变化。结果15例CA皮损较正常对照组织[(18.8 ± 4.0)个 /高倍视野] LC数量明显降低（P＜0.01），表皮内LC分布不规则，大部分LC结构不完整，细胞突减少、缩短甚至消失，缺少LC的典型特征，点状或条索状。个别皮损表皮内LC缺失，而其真皮内见到不典型的LC。PDT治疗后即刻组LC数量[(9.2 ± 2.0)个/高倍视野]较治疗前组[(6.2 ± 1.8)个/高倍视野]明显升高（P＜0.05），治疗后7 d组LC数量[（6.4± 1.1）个/高倍视野]回落接近治疗前水平（P＞0.05），差异无统计学意义。结论CA患者皮损局部细胞免疫功能低下，作为抗原提呈细胞的LC，其数量和形态发生改变。PDT能诱导CA皮损局部LC数量及形态发生明显改变，具有调节局部免疫的作用。

尖锐湿疣；光动力疗法；朗格汉斯细胞；免疫组化

[J Pract Dermatol, 2017, 10(2):70-72]

尖锐湿疣（condyloma acuminatum，CA）是由于感染人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）而引发的一种常见的性传播疾病。有研究显示[1]，CA皮损部位的朗格汉斯细胞（Langerhans cell，LC）数量减少，形态发生改变，无法将表皮内的病毒抗原提呈给存在于真皮的免疫活性细胞，因此不能形成HPV相关的特异性免疫反应，使皮损持续存在或在治疗后易于复发。光动力疗法（photodynamic therapy，PDT）是近年来兴起的一种治疗方法，用于治疗多种肿瘤[2,3]及良性皮肤病变[4]，取得了显著疗效。该方法能够改善局部的免疫应答[5,6]，通过细胞因子、生长因子、补体系统分子和急性期蛋白[7]等相关炎症递质释放，产生或增强抗肿瘤免疫反应[8]。PDT对改善HPV感染治疗现状具有重要意义[9]。本文应用免疫组化的方法对初发CA皮损中的LC进行研究，观察PDT治疗前后皮损中LC的分布及形态学改变，同时对LC数量进行半定量分析，从而揭示PDT治疗CA的免疫学机制。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

2012年4月—2013年4月，在北京世纪坛医院皮肤性病门诊就诊的15例初发CA患者，均经临床和组织病理确诊为CA。15例患者中男7例，女8例，年龄16～42岁，病程1～8周。15例患者随机分为3组，每组5例，即PDT治疗前组、治疗后即刻组及治疗后7 d组，每组性别、年龄分布较一致，具有可比性。正常对照组为5例行包皮环切术的健康人。本研究已通过北京世纪坛医院科学研究伦理委员会同意。

1.2 方法

1.2.1 PDT治疗前后的取材与染色 CD1a鼠抗人单克隆抗体（英国Novocastra Laboratiories 有限公司），NovoLinkTM Polymer检测系统（上海泉晖生物技术有限公司）。治疗前组的5例患者在进行PDT治疗前皮损局部取材，用10%福尔马林固定后制成蜡块，切成4 μm薄片，置于多聚赖氨酸处理过的玻片上，依照CD1a免疫组化试剂盒说明书进行染色；15例患者均进行PDT治疗，PDT治疗后即刻组在治疗后即刻、治疗后7 d组在治疗后7 d，分别在治疗部位取材并染色，具体方法同前。5例正常对照为包皮环切术后的正常皮肤组织，以Tris盐酸缓冲液代替一抗。

1.2.2 PDT 用5-氨基酮戊酸散（ALA，商品名：艾拉，每瓶118 g，上海复旦张江生物医药股份有限公司）配置20%ALA溶液。用0.4%的氯己定溶液对疣体及周边黏膜进行常规消毒；在疣体部位放置适当大小的滴有ALA溶液的脱脂棉球，并覆于疣体上，范围覆盖至皮损周边2 cm内正常外观的皮肤黏膜；ALA外用封包3 h后，局部给予照射能量100 mW的100 J/cm2的半导体激光垂直照射。

1.2.3 光镜下观察 镜下见细胞膜或胞质呈黄褐色树枝状突起的细胞即CD1a染色阳性的LC。观察其分布及形态特点，每张切片任取5个LC分布最为密集的高倍视野，计数LC的数量，并计算阳性细胞密度= 5个视野阳性细胞总数/5 个视野总细胞数，以其作为最终的结果进行分析。

1.3 统计学方法

观察对比PDT各组与正常对照组的LC的分布及形态，各组间结果采用单因素方差分析进行统计学分析。

图1 正常对照组与PDT各组LC变化的比较（SP法×400）

2 结果

2.1 光镜下LC的分布及形态学改变

正常对照组表皮中可见较多CD1a染色阳性的细胞，胞体圆形、椭圆形或不规则形，细胞膜或胞质呈黄褐色，具有3～4个细长的树枝状突起，亦呈黄褐色，细胞位于基底细胞间或棘细胞间，少数LC结构不完整或突起不明显（图1a）。

PDT各组：LC分布不规则，数量明显减少，胞体较正常组小，结构不完整，树突明显减少、缩短或消失，二级突起极少见到，胞突呈点状或条索状，典型的树突状结构的LC少见。细胞多位于表皮下部，个别病损表皮中LC消失，真皮浅层见到不典型的LC。相对于PDT治疗前组，PDT治疗后即刻组及治疗后7 d组真皮中CD1a染色阳性的LC数量明显增多，但缺少典型的树突状结构，这种形态学改变在治疗后7 d组更明显（图1b-1d）。

LC含量在正常对照组和PDT各组分别为[(18.8 ± 4.0)个/高倍视野]和[(7.3 ± 2.1)个/高倍视野]，后者的LC含量均显著低于前者（表1），差异具有统计学意义（P＜0.05）；治疗后7 d组与治疗前组相比不具有显著性差异，LC数量回落接近治疗前水平，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 正常对照组及PDT各组皮损LC数量（个/高倍视野，±s）

表1 正常对照组及PDT各组皮损LC数量（个/高倍视野，±s）

组 别 例数 数量范围 LC数量 阳性细胞密度（%）正常对照 5 15～25 18.8 ± 4.0 6.42 PDT治疗前组 5 4～8 6.2 ± 1.8 2.00 PDT治疗后即刻组 5 7～12 9.2 ± 2.0 3.07 PDT治疗后7 d组 5 5～8 6.4± 1.1 2.27

2.2 各组间均数单因素方差分析

CA各组与正常对照组间经均数单因素方差分析，差异具有统计学意义（P＜0.05），但各组间应用Q检验差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

LC是来源于骨髓及脾的树突状细胞，主要位于表皮内，具有较强的抗原提呈作用，向T淋巴细胞提呈抗原的同时，激活T淋巴细胞进行免疫应答[10,11]，在病毒性皮肤病中起着重要的防御和传递病毒抗原的作用。

自20世纪70年代末问世以来，PDT应用于HPV相关性疾病取得了显著效果[12,13]。PDT能够有效改善CA患者皮损的免疫抑制状态[14]，而其中LC发挥的作用有待进一步研究。

CD1a是LC细胞表面最重要的标志，且LC是皮肤内惟一能与CD1a抗体相结合的细胞。本试验采用免疫组化的方法，利用CD1a单克隆抗体对正常包皮组织及CA皮损进行染色，观察LC在治疗前后的变化。考虑到复发CA患者存在明显的局部免疫功能低下，由此产生的治疗抵抗可能会干扰进一步的分析，因此，本试验仅选取了15例初发CA患者。

结果显示，对照组正常表皮中可见较多典型的树突状LC细胞，分布较均匀，而CA皮损表皮内LC分布不规则，数量明显减少，大部分LC结构不完整，细胞突减少、缩短甚至消失，缺少LC的典型特征，点状或条索状，个别皮损表皮内LC缺失，而其真皮内见到不典型的LC。说明感染HPV时，可能通过HPV的直接作用使LC发生形态学的改变，局部病毒抗原刺激LC从表皮游走至真皮，进而介导激活免疫应答反应。PDT治疗后即刻组及治疗后7 d组，其真皮中CD1a染色阳性的LC数目明显增多，提示免疫介导作用明显加强。

研究中，15例CA患者无论治疗与否，皮损中LC数量均显著低于正常对照组（P＜0.01）。PDT治疗前组皮损中的LC变化与文献报道相似[15]；PDT治疗后即刻组，皮损真皮内的LC数量明显增多，这可能与PDT直接或间接（细胞因子或趋化因子等）活化LC、激活局部细胞免疫或使真皮内LC受到炎症趋化迁移至PDT反应局部有关；治疗后7 d组，LC数量回落，接近治疗前水平，但LC分布发生了明显变化，其分布以真皮为主，表皮内少见或罕见，这可能与LC活化后不断向引流淋巴结迁移以完成抗原提呈过程或通过PDT诱发表皮内LC发生细胞凋亡密切相关，重新分布的LC其活性有待进一步研究[1]。

HPV感染后存在于角质形成细胞内，释放的病毒颗粒位于角质层上方，而通常LC分布于表皮中下层，以上特点使得LC对HPV的免疫应答受到限制，LC趋化所需的抗原和炎症信号也十分有限。PDT诱发皮损局部产生炎症和免疫应答，使亚临床状态下的HPV病毒颗粒更好地暴露在LC面前，免疫应答受限得到明显改善。这对于彻底清除HPV，最终获得临床治愈有着重要的意义。

综上所述，PDT能够诱导LC重新分布，使其数量和形态学发生显著变化，通过加强LC对HPV的抗原提呈作用，加强局部的细胞免疫，对减少随后持续存在的HPV感染、降低复发、获得临床治愈具有重要意义。

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Effect of photodynamic therapy on Langerhans cells in lesion area of condyloma acuminatum

LIU Yong-xin，ZHENG He-yi
Department of Dermatology and Venereology, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038, China

ObjectiveTo investigate the alteration of Langerhans cells (LCs) in local lesions of Condyloma Acuminatum(CA) patients around PDT.MethodsThe CD1a staining in 15 specimens of CA before and after the PDT was evaluated by immunohistochemical technique, as well as 5 positive controls. The morphology changes of LCs were observed through high power lens.ResultsThe alteration of Langerhans cells in local lesions of CA patients around PDT including: histopathological study showed far fewer LCs in all CA lesions(P＜0.01) compared with normal controls (18.8 ± 4.0 / highpower f eld); the dendritic structure of LCs reduced, shortened or even completely disappeared; atypical LCs without distinctive dendritic structure were detected in the dermis in some specimens; the number of LCs instantly after PDT (9.2±2.0/highpower field) was remarkable higher than the level before the treatment (6.2±1.8 /highpower f eld)(P＜0.05). Meanwhile, 7 days after the treatment, the number of LCs (6.4±1.1/ highpower f eld) declined approaching to the level before the PDT(P＞0.05, without statistic difference).ConclusionThe cellular immunity was impaired in CA lesions. The PDT could improve the local immune state through modifying the characteristics of LCs, which might act as an immunologic regulator in the cure of CA.

Condylomata acuminata；Photodynamic therapy；Langerhans cell；Immunohistochemistry

R752.53

A

1674-1293(2017)02-0070-03

2016-10-10

2017-01-18）

（本文编辑 耿建丽）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170202

100038北京，首都医科大学附属北京世纪坛医院皮肤性病科（刘永鑫）；中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院皮肤性病科（郑和义）

刘永鑫，医学博士，医师，从事皮肤性病科临床工作，E-mail: lyx3179@163.com