肝核受体激动剂对人表皮鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖作用的影响

李漪倩，诸 蓉，蔡小薇，张 斌，王儒鹏，何 威

• 论 著 •

肝核受体激动剂对人表皮鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖作用的影响

李漪倩，诸 蓉，蔡小薇，张 斌，王儒鹏，何 威

李漪倩

目的探讨肝核受体LXRs激动剂T0901317人表皮鳞状细胞癌SCL-1细胞增殖的影响及可能机制。方法CCK-8法检测不同浓度T0901317（1.0、10.0、20.0 μmol/ L）作用SCL-1细胞24、48、72 h后细胞增殖率的变化。流式细胞仪检测不同浓度肝核受体激动剂对SCL-1细胞周期分布的影响。反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及免疫印迹试验（Western blot）检测肝核受体激动剂对细胞周期相关因子PCNA、p21、p27、CCND1表达水平的影响。结果T0901317可明显抑制SCL-1细胞增殖，并呈现一定的时间和浓度依赖性；肝核受体激动剂作用于细胞株后，SCL-1细胞的G1期百分率上升，而S期、G2 期百分率下降；且在一定浓度范围内导致细胞周期因子p21的mRNA及蛋白表达增加，而其他细胞周期相关因子表达未见明显变化。结论肝核受体LXRs激动剂可能通过促进细胞周期调节负性因子p21的表达，导致细胞周期静息甚至停滞于G1期，从而抑制细胞增殖。

癌，鳞状细胞；SCL-1细胞；LXRs；p21；G1期阻滞

[J Pract Dermatol, 2017, 10(2):65-69]

皮肤鳞状细胞癌 (squamous cell carcinoma，SCC，简称皮肤鳞癌)，是皮肤科临床上最常见的皮肤恶性上皮细胞肿瘤[1]，近年来，皮肤鳞癌的发生率呈逐年升高趋势。该病不仅可以导致患者容貌改变或毁损而影响美观，还可因可能发生的肿瘤转移而威胁患者的健康，严重影响患者的生活质量。但目前为止，皮肤鳞癌的发病机制目前仍不十分清楚。肝脏X受体（liver X activated receptors，LXRs）是代谢性核受体家族的成员之一，目前已鉴定发现LXRα和LXRβ两种亚型。且两种受体在人类皮肤中均有表达[2]。近年来有研究表明，LXRs直接或者间接诱导参与了调控肿瘤有关糖脂代谢的基因表达，参与了肿瘤的发生发展。已有部分研究发现LXRβ经激动剂T0901317作用可以发生活化，并使得一些肿瘤细胞的增殖得到抑制[3,4]。但其在皮肤鳞癌SCC发病中的作用及机制尚不明确。本实验采用LXR激动剂T0901317处理体外培养的皮肤鳞癌SCL-1细胞，观察其对皮肤鳞癌细胞增殖抑制作用的影响，并探索其产生作用可能的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞（广州吉妮欧生物技术公司）。主要试剂1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（美国Gibco公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），T0901317（美国Sigma公司），DMSO（美国Sigma公司）。Trizol（美国Invitrogen公司），反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）试剂盒以及PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。兔抗人p27抗体（美国Abcam公司），兔抗人p21抗体（美国Abcam公司），兔抗人CCND1抗体（美国Abcam公司），兔抗人PCNA抗体（美国abcam公司），鼠抗人β-肌动蛋白抗体（德国Santacruz公司）。羊抗鼠及羊抗兔二抗（中杉金桥）。BCA 蛋白浓度测定试剂盒（中国碧云天生物技术公司），蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟和细胞裂解液（Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与药物处理 SCL-1细胞生长于含10%FBS 、100 U/L青霉素及0.1 mg/ml 链霉素的1640培养基中，置于37℃、5% CO2温箱培养，2～3 d传代1次。将用DMSO溶解的T0901317，溶解浓度为0.01 mol/L，保存于-80℃冰箱中，实验前用培养基稀释成终浓度。

1.2.2 CCK-8法 将处于对数生长期的SCL-1细胞接种于96孔培养板中，每孔100 μl，3 000个细胞，待细胞完全贴壁后分别加入不同浓度的T0901317，使其终浓度为 1.0、10.0、20.0 μmol/L 和 0.1% 的 DMSO，其中每孔设3个复孔，阴性对照孔只加1640培养基，继续培养24、48、72 h后每孔加入CCK-8各10 μl，继续培养2 h，将96孔板放置在酶标仪上，选定450 nm波长，测定各孔的A 值。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期 将对数生长期的SCL-1细胞以1×105个接种在6孔板中。在37℃、5%CO2条件下孵育24 h，去上清液，加入含1.0、10.0、20.0 μmol/L的T0901317的培养基2 ml（对照组为空白培养基），作用24 h后，将贴壁细胞用0.25%的胰酶消化后，加入预冷的PBS清洗细胞。去上清液后，缓慢加入-20℃ 的70%乙醇过夜。上机前加入含 1 mg/ml的 Rnase 的碘化丙啶(10 mg/L)，4℃条件下染色30 min在流式细胞仪上测定。

1.2.4 RT- PCR 使用RT- PCR即实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction)检测增生细胞核抗原 ( proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、细胞周期蛋白D1(CCND1)、p21、p27基因的表达。步骤如下：将约1×105个细胞接种在6孔板中，给予T0901317刺激 24 h后的进行裂解，采用TRIzol提取各组细胞中的总RNA，将1 μg总RNA按照反转录试剂盒的操作步骤反转录成cDNA。以cDNA 作为PCR模板，-20℃ 保存。引物序列：p21上游引物 5'-GCCCGCTCTACATCTTCTG-3'，下游引物 5'-GTGCCATCTGTTTACTTCTCAA -3'，扩增产物 424 bp。以β-肌动蛋白作为内参照 (285 bp)，上游引物 5'-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'，下游引物 5'-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3'。p27引物序列：上游引物5'-CAAGTACGAGTGGC AGAGGTG-3',下游引物，5'-ATGCGTGTCCTCAG AGTTAGCC -3'，扩增产物172 bp。PCNA上游引物：5'- TGATGAGGTCCTTGAGTG-3'，下游引物5'-GAGTGGTCGTTGTCTTTC- 3', 扩增产物为 332 bp。CCND1上游引物：5'-GAACACGGCTCACGCTTAC-3'，下游引物 ：5'-TTGTGCCCTTGCCCCATC-3'，扩增片段 105 bp。PCR条件:采用 SYBR Green 染料法进行实时PCR检测。根据试剂盒要求配制反应体系，反应条件为94℃预变性 5 min，然后94℃变性 1 min，58℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，扩增35 个循环，最后 72℃延伸 10 min。β-肌动蛋白扩增28个循环。各样本结果均用其相应的β-肌动蛋白标化。

1.2.5 总蛋白的提取及Western blot 采用Western blot检测PCNA、p21、p27、CCND1蛋白的表达。步骤如下：细胞的铺板和药物处理同前一项，弃去培养液后，用PBS清洗细胞，弃去残余液体，每管以一定比例加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂PMSF，置于冰浴中 30 min，使细胞充分裂解，12 000 r/ min离心15 min，取上清液于另一新的EP管中，用BCA 法测定蛋白浓度。将所提取的蛋白加入 5×SDS 蛋白上样缓冲液煮沸备用，取 40 μg的细胞蛋白样品上样于配制好的10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，用湿转的方法将蛋白转至 PVDF膜上。湿转结束后，用5%脱脂奶粉将PVDF膜于37℃孵箱封闭1 h，后将膜封入含有兔抗人p21单克隆抗体( 工作浓度 1:1 000) 、兔抗人p27单克隆抗体( 工作浓度 1:1 000)、兔抗人PCNA单克隆抗体( 工作浓度 1:1 000)、兔抗人CCND1单克隆抗体( 工作浓度 1:1 000)及鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体( 工作浓度 1:500)的封闭液的小塑料袋内, 4℃过夜。取膜用TBST洗3次，每次10 min。洗后1:5 000稀释二抗，于 37℃孵育1 h ，TBST洗3次后在暗室中用化学发光底物法将 PVDF膜曝光。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料采用 t 检验，采用2-△△CT法计算Real-Time PCR所得的计量方法进行分析。以 P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度LXR受体激动剂作用于SCL-1细胞不同时间对其增殖的影响

使用加入含1.0、10.0、20.0 μmol/L的LXR受体激动剂T0901317分别作用于SCL-1细胞24 h、48 h、72 h后，测得450 nm处A值，计算中以A 值表示，行统计学分析，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。LXR受体激动剂T0901317对细胞的增殖有抑制作用，且随时间浓度抑制作用呈增强趋势（图1）。

药物对细胞增殖的抑制率计算公式：抑制率=1-[A(加药) -A（空白）]/[ A（对照）- A（空白）]。A（加药）：具有细胞、CCK溶液和药物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培养基和CCK溶液而没有细胞的孔的吸光度；A（对照）：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

2.2 不同浓度LXR受体激动剂作用24 h对SCL-1细胞周期分布的影响

不同浓度T0901317作用于细胞后，在20.0 μmol/L的浓度作用下SCL-1细胞中G0/G1期细胞比例分别为68.86%和68.96%，明显高于对照组47.51%，差异有统计学意义（P＜0.01）；而S期细胞比例中，T0901317处理组也显著低于对照组（ P＜0.01），提示LXR激动剂可诱导体外培养的SCL-1细胞周期中的G0/G1期细胞比例升高，而S期细胞比例则明显降低（表2，图2）。由此LXR受体激动剂可能抑制细胞由G1期进入S期，导致细胞周期停滞，从而抑制细胞增殖。

表1 不同浓度LXR受体激动剂T0901317作用SCL-1细胞不同时间后的抑制率 （±s，%）

表1 不同浓度LXR受体激动剂T0901317作用SCL-1细胞不同时间后的抑制率 （±s，%）

注：空白对照组的抑制率值皆为0，与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

T0901317处理组 1.0 μmol/L 10.0 μmol/L 20.0 μmol/L 24 h 0.040±0.050 0.090±0.090 0.250±0.030**48 h 0.240±0.130 0.310±0.110**0.430±0.030**72 h 0.550±0.008*0.590±0.024**0.640±0.011**

图1 T0901317作用不同时间不同浓度的增殖抑制情况

表2 不同浓度LXRs激动剂作用于SCL-1细胞24 h后流式得细胞周期各数值

图2 对照组、20.0 μmol/L T0901317组作用24 h后细胞周期分布结果图

表3 不同浓度LXR受体激动剂T0901317作用皮肤鳞癌SCL-1细胞后相关基因的2-△△CT值 （±s）

表3 不同浓度LXR受体激动剂T0901317作用皮肤鳞癌SCL-1细胞后相关基因的2-△△CT值 （±s）

注：与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

T0901317 空白对照组 1.0 μmol/L 10.0 μmol/L 20.0 μmol/L PCNA 1.062±0.044 1.024±0.039 0.680±0.077*0.150±0.090**p21 1.880±0.280 3.210±0.120**5.120±0.310**6.560±1.650**p27 1.130±0.210 1.110±0.150 1.160±0.130 1.048±0.200 CCND1 1.090±0.100 1.130±0.100 1.120±0.110 1.120±0.110

2.3 实时荧光定量PCR检测细胞周期相关因子基因表达变化

1.0 、10.0、20.0 μmol/L T0901317处理细胞24 h后，细胞周期相关因子mRNA的相对表达见表3。PCNA mRNA的表达水平呈下降趋势（P ＜0.05），而p21 mRNA的表达水平则呈上升趋势，差异具有统计学意义（P＜0.01）。而p27及CCND1的mRNA表达未见明显变化（P＞0.05）（图3）。

2.4 不同浓度LXR受体激动剂作用对SCL-1细胞中细胞周期各相关因子蛋白表达的影响

与对照组相比，分别以1.0、10.0和20.0 μmol/L的T0901317处理细胞24 h后，Western blot检测PCNA蛋白表达明显降低，而p21蛋白表达水平有明显上升的趋势，蛋白的表达水平与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。CCND1及p27蛋白表达无明显变化，各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图4、5）。

图3 不同浓度T0901317作用24 h后对细胞周期因子mRNA表达的影响

图4 对照组及1、10、20 μmol T0901317剂量诱导下的周期因子蛋白表达

图5 灰度扫描分析蛋白PCNA、p21 的表达变化

3 讨论

目前已有许多研究表明，肿瘤脂类异常代谢是整个肿瘤代谢紊乱或称肿瘤代谢重编程的重要组成部分。几乎所有类型的肿瘤细胞都可以表现出内源性的脂肪酸从头合成能力的增强[5]。研究如何通过阻断脂类代谢相关途径抑制肿瘤细胞中能量的生成，从而达到治疗恶性肿瘤的目的正成为新的治疗替代方案[6]。LXRs作为一种氧化固醇激活的核受体，其参与机体的多种生理活动的调节，包括胆固醇的代谢和转运，脂肪的形成，糖类的代谢和炎症等过程。

LXRs的调控涉及多条信号转导通路，关系较为复杂。在肿瘤类疾病中的研究认为，LXRs在不同类型肿瘤生理过程中可能发挥双重作用，一方面LXRs可抑制包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤等多种肿瘤细胞的增殖[3,7-9]；另一方面，某些肿瘤组织本身可以产生LXR激动剂，抑制机体本身的免疫反应，从而使肿瘤细胞免于免疫系统监视[10]。在一项口腔鳞癌的研究中，发现LXR受体激动剂减弱了肿瘤的生长，而其中肿瘤细胞内ATP结合盒转运蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）表达上调，而细胞内胆固醇的水平有所降低[11]。在分子机制水平上，LXRs可通过使细胞周期促进因子的表达降低，升高抑制因子的表达来靶向调节细胞周期的几个关键点。尽管LXRs对细胞周期的所有调节因子活性都可能有所影响，但似乎主要集中于G0/G1期，从而导致细胞周期静息。笔者的前期研究发现，无论在体外培养鳞癌细胞，抑或人原位鳞癌组织中均存在肝脏X受体的表达升高。

本实验的研究结果显示，在1.0～20.0 μmol/L的浓度范围内T0901317试剂可抑制皮肤鳞癌SCL-1细胞增殖，并在一定程度上呈现时间及剂量依赖性。而流式细胞仪检测结果提示，激活LXRs可阻滞SCL-1细胞周期进程，将细胞阻滞于G1期，提示其可以通过改变细胞周期的进程而抑制SCL-1细胞生长。RT-PCR及 Western blot的检测结果均提示经过LXRs激动剂处理后，作为评定细胞增生活性标志物的PCNA mRNA和其蛋白的表达水平明显降低。而其他细胞周期相关调节因子中，细胞负性调节因子p21的表达则明显上升，其余细胞周期相关因子则未出现明显的变化趋势。p21是最先发现的一类重要的广谱细胞周期蛋白激酶抑制因子，几乎能抑制所有周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶复合物的活性，使得细胞周期停滞，细胞的增殖受到抑制[12]。它受癌基因p53的调节，在依赖p53的表达通路上与肿瘤的表达含量、表达位置，以及肿瘤的最终预后都有着密切的关系。而在乳腺癌的研究中已发现LXR激动剂能够升高p53的表达[13]。因此，笔者推测肝核受体激动剂作用可能正是通过调节细胞周期抑制因子p21的表达，从而抑制细胞周期进程，导致细胞周期停滞，使得细胞增殖得到抑制，但其具体机制尚有待进一步的实验证实。

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Effects of LXRs agonists on the proliferation of SCL-1 cells

LI Yi-qian，ZHU Rong，CAI Xiao-wei，et al
Department of Dermatology, the Second Aff liated Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

ObjectiveTo detect the effects of LXRs agonists T0901317 on human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1.Methods24,48 and 72 hours after T0901317(1.0, 10.0, 20.0 μmol/L) with different concentrations acting on SCL-1 cells, CCK-8kit assay was performed to detect cell proliferation. After having been treated with T0901317(1.0, 10.0, 20.0 μmol/L) for 24 hours, SCL-1 cells cycle progression was analyzed by flow cytometry. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of cell cycle related factors’ genes and proteins.ResultsT0901317 inhibited the proliferation of SCL-1 cells in the concentration and time dependant manners. The proportion of SCL-1 cells in G1-phase increased, while that in G2- and S-phase decreased after having been treated with T0901317 (1.0, 10.0 ,20.0 μmol/L) for 24 hours. The result of PCR and Western blot showed that the expression of p21 protein was up-regulated, but the other cell cycle factors had no obviously changes.ConclusionThe inhibition of SCL-1 cells proliferation by LXRs agonists is involved in G1-phase arrest, which might be related to the increased expression of p21 factor.

Aarcinoma，squamous cell；SCL-1 cells；LXRs；p21；G1-phase arrest

R739.5

A

1674-1293(2017)02-0065-05

2016-12-15

2017-01-09）

（本文编辑 耿建丽）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170201

国家自然科学基金青年基金资助项目（81502369）

400037 重庆，第三军医大学附属新桥医院（李漪倩，诸蓉，蔡小薇，张斌，王儒鹏，何威）

李漪倩，硕士研究生，住院医师，研究方向 ：皮肤肿瘤，E-mail: 619104962@qq.com

何威，E-mail: weiheskin@163.com