镉胁迫对两种芒属植物叶片抗氧化酶系统的影响

黄湘吉，杨友才

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

镉胁迫对两种芒属植物叶片抗氧化酶系统的影响

黄湘吉，杨友才

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

以芒属植物A0104和C0424两个品种的幼苗为材料，采用水培的方式探讨了Cd胁迫对芒属植物叶片抗氧化酶系统的影响。结果表明：当Cd浓度为1～2 mg/L时，Cd胁迫对C0424的影响较小，当Cd浓度增加至3～4 mg/L时，C0424体内氧化应激加剧；而A0104在1～4 mg/L的Cd胁迫浓度下均发生了强烈的氧化应激反应。这表明C0424在Cd耐性方面优于A0104。

Cd胁迫；抗氧化系统；芒属植物

土壤是人类赖以生存的自然资源，也是人类生态环境的重要组成部分。随着社会的进步，在工业生产和日常生活中，重金属的使用越来越频繁，使用后的重金属得不到有效的处理，随意排放到环境中，大气、土壤和地表水中的重金属通过植物的富集再由食物链进入到人体内，会对身体造成不良影响，甚至威胁到人类的健康。因此，土壤重金属污染成为现阶段农业生产最为突出的问题之一[1]。重金属在土壤中的形态变化复杂，常用的传统修复方法可分为3大类：物理方法、化学方法和生物方法。其中，生物方法中的植物修复技术是目前研究的热点。植物修复技术就是指利用对重金属富集能力较强的植物吸收土壤中的重金属污染物，然后将其转移到植物地上部分，从而达到去除和降低土壤中重金属含量的目的[2]。研究表明，芒属植物能在盐碱地中生长，说明其具有较强的抗逆性[3]；已有报道称芒属植物中的五节芒对铅、锌等金属有较好的耐性和积累作用；同时，芒属植物的生物量很高。因此，芒属植物在重金属污染土壤修复领域应用前景广阔。

为了探讨不同浓度的Cd胁迫对芒属植物苗期生理生化指标的影响以及不同品种的芒属植物对Cd的积累特征，选用A0104和C0424两个品种作为对比，采用水培人为添加Cd的方式，培养30 d，测定各处理叶片POD、SOD、CAT的活性和MDA含量，进而分析Cd胁迫对这两种芒属植物生长的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试植物材料为芒属植物A0104和C0424幼苗（株高5 cm左右，3片真叶），由湖南农业大学芒属植物资源圃提供。

主要试验试剂有硝酸、高氯酸、磷酸缓冲液、愈创木酚、过氧化氢、三氯乙酸、Met溶液、NBT溶液、EDTA-Na2溶液、核黄素溶液和Cd标准溶液；主要试验设备有烘箱、恒温水浴、制冰机、离心机、分光光度计、荧光灯、粉碎机、消解仪和ICPE-9000金属原子检测仪等；还有实验室常用器材，如消解管、移液枪、移液管、容量瓶、烧杯、研钵、量筒、试管、指形管、小药瓶和离心管等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 将供试材料移栽到漂浮盆中，移栽完毕后，浇一次水，并向水中添加霍格兰营养液。待幼苗正常生长10 d后，向培养液中添加Cd（以硝酸镉的形式添加），使培养液中Cd浓度分别为0、1、2、3、4 mg/L，分别编号为CK、T1、T2、T3和T4处理。培养30 d后取样，期间定时补充水分，保持培养液中Cd浓度不变。

1.2.2 SOD的测定 取0.5 g样品清洗干净，置于预冷的研钵，加入1 mL预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5 mL，倒入离心管，在4℃、10 000 r/min下离心20 min，上清液为酶提取液。取5 mL指形管4支，2支测定管，2支对照管，加入酶提取液（对照管加等量缓冲液），将1支对照管暗处理，其他管至于4 000 Lx荧光灯下反应20 min，在560 nm处测定吸光度。

式中，ACK为对照管（照光）的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为加入PBS的体积（mL）；Vt为测定时酶液的用量（mL）；W为样品重量（g）。

1.2.3 POD的测定 取酶提取液0.1 mL加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L）2.9 mL、2%H2O21 mL、0.05 mol/L愈创木酚1 mL，用加热煮沸5 min的酶提取液作为对照。置于37℃的水浴中反应15 min，然后转入冰浴，加入20%三氯乙酸2 mL终止反应，在470 nm处测定吸光度。

式中，ΔA470为反应时间内吸光度的变化；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）；VT为酶提取液总体积（mL）；VS为测定时取用的酶液体积（mL）。1.2.4 CAT的测定 取10 mL试管3支，分别加入0.2 mL酶提取液，然后加入磷酸缓冲液1.5 mL及蒸馏水1 mL，对照组在沸水浴煮沸1 min。然后向每个试管加入0.3 mL 0.1mol/L的H2O2，每加完一次立即计时，马上在240 nm处测定其吸光度，每隔1 min读数1次，共测4 min。

式中，ΔA240为反应时间内吸光度的变化；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）；VT为提取酶液总体积（mL）；VS为测定时取用酶液体积（mL）。

1.2.5 MDA含量的测定 取叶片样品0.2 g加入1.6 mL10% TCA研磨成浆，倒入离心管在12 000 r/min离心10 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL 0.67% TBA，在沸水浴煮30 min，冷却后离心，取上清液分别在450、532、600 nm处测吸光度[4]。

MDA浓度C(μmol/L)=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

MDA含量（μmol/g FW）=C×V/W

式中，V为提取液的体积（L），W为样品重量（g）。

1.3 数据分析

试验各项数据采用Excel 2010和SPSS 18.0软件进行分析处理，采用单因素ANOVA法进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对芒属植物叶片SOD活性的影响

从图1中可以看出，随着Cd浓度的升高，A0104叶片中SOD活性呈逐步上升的趋势，T4处理的叶片SOD活性达到最高值，约为CK的1.7倍。与A0104品种不同，C0424在T1和T2处理时，叶片SOD活性随Cd浓度的升高而降低，随后在T3、T4处理出现反弹，叶片SOD活性急剧升高，T4处理的叶片SOD活性最高，约为对照的1.5倍。

图1 不同浓度Cd处理下A0104和C0424的叶片SOD活性

2.2 Cd胁迫对芒属植物叶片POD活性的影响

如图2所示，两个品种叶片的POD活性均随Cd浓度的增加而上升，T1处理的POD活性上升程度较轻，A0104和C0424分别比对照升高了29%和23%，当Cd浓度增加至4 mg/L（T4处理）时，A0104和C0424品种的POD活性分别是对照的2.6和1.5倍。

2.3 Cd胁迫对芒属植物叶片CAT活性的影响

如图3所示，不同Cd浓度处理对A0104和C0424叶片的CAT活性均有一定影响。随着Cd处理浓度的升高，A0104叶片中CAT活性呈下降趋势，当Cd浓度为2 mg/L时，叶片CAT活性下降率为10.62%，下降程度较轻；当Cd浓度上升至4 mg/L时，叶片CAT活性急剧下降，比对照下降了35.16%。而在C0424品种中，T1～T2处理的叶片CAT活性比对照有所提升，其中T2处理的CAT活性上升了26.57%；但当Cd浓度增加至3～4 mg/L（T3～T4处理）时，叶片中CAT活性明显降低，其中T4处理的叶片CAT活性与对照下降了26.83%。

图2 不同浓度Cd处理下A0104和C0424的叶片POD活性

图3 不同浓度Cd处理下A0104和C0424的叶片POD活性

2.4 Cd胁迫对芒属植物叶片MDA含量的影响

从图4中可以看出，随着Cd浓度的升高，A0104品种叶片中MDA含量也随之增加，叶片膜脂过氧化的程度随之加深，T4处理的叶片MDA含量约为对照的2.1倍；与A0104相同，C0424品种叶片中MDA含量也随环境中Cd胁迫浓度的升高而增加，T4处理的叶片MDA含量约为对照的1.7倍；但C0424叶片中MDA含量均低于A0104，除T3处理外，其他处理两者之间MDA含量差异显著。

图4 不同浓度Cd处理下A0104和C0424的叶片MDA含量

3 结论与讨论

植物能够在一定的Cd胁迫范围内正常生长，同时积累一定量的Cd。植株抗氧化系统在清除活性氧、维持膜系统稳定中起到了非常重要的作用。随着环境中Cd胁迫的逐渐加重，会导致植物MDA含量的增加，从而加深膜脂过氧化的程度，进而抑制植物的生长和发育[5]。

SOD存在于细胞的各组成部分中，它能够消除新陈代谢过程中产生的有害物质[6]。试验结果表明，A0104叶片中SOD活性随Cd胁迫浓度的升高而增强，C0424则表现出先降后升的趋势，在T1、T2处理时，C0424叶片SOD活性比对照低，说明C0424对低浓度的Cd胁迫适应性较强；当Cd胁迫浓度上升至3～4 mg/L时，叶片SOD活性随之增强，说明Cd胁迫浓度大于2 mg/L（T2）后，C0424叶片开始产生大量的SOD用于解毒；两个品种相比，C0424在试验设计的4个浓度中SOD活性均小于A0104。由此可知，在Cd浓度为1～4 mg/L时，C0424对Cd的耐性要高于A0104。

POD是细胞内一种比较重要的抗氧化酶，细胞内外的POD均能参与H2O2的清除[7]。在重金属胁迫下，植物叶片的过氧化物酶活性表现出增强的趋势[8]。同时，POD在衰老细胞中含量较高，也可作为细胞衰老的标志之一。与前人的研究结果相似，A0104和C0424两个品种叶片POD活性都随着Cd胁迫浓度的升高而增强，说明Cd胁迫加速了两个品种叶片细胞的老化进程。当Cd浓度为1 mg/L时，A0104叶片POD活性低于C0424，说明在该浓度下A0104叶片细胞衰老的速度低于C0424。当Cd浓度增加至2～4 mg/L时，A0104叶片POD活性急剧升高，说明高浓度（2～4 mg/L）的Cd胁迫加速了A0104品种叶片细胞衰老；而品种C0424的叶片POD活性则呈缓慢增强的趋势，且低于A0104品种；这也说明C0424较A0104对高浓度的Cd环境更具耐性。

过氧化氢酶（CAT）是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，可以分解活性氧——羟基自由基，从而达到为机体解毒的作用。试验结果表明，A0104叶片CAT活性随着Cd胁迫浓度的升高而减弱；而C0424则表现出先升后降的趋势，当Cd胁迫浓度为1～2 mg/L时，CAT活性高于对照，当Cd胁迫浓度＞2 mg/L时，CAT活性减弱；在不同Cd胁迫浓度下C0424叶片的CAT活性均低于A0104。

丙二醛（MDA）含量是植物细胞膜质过氧化程度的体现。丙二醛含量高，说明植物细胞膜质过氧化程度高，细胞膜受到的伤害严重。在逆境环境下，植物会发生膜脂过氧化；当植物体内存在过剩的活性氧自由基时，也能发生膜脂过氧化[9]。Cd胁迫会使叶片细胞发生膜脂过氧化，随着Cd胁迫浓度的升高，膜脂过氧化反应加强，A0104和C0424都是如此。当Cd胁迫浓度为3 mg/L时，两个品种之间的MDA含量差异不显著（P＞0.05）；其他浓度时，A0104叶片MDA含量均高于C0424，也就是说A0104在Cd胁迫下叶片细胞膜脂过氧化的程度高于C0424。

植物的抗氧化系统在防御外界胁迫时起到了至关重要的作用[10]。总的来讲，C0424在Cd胁迫环境下的适应性表现比A0104要好。在低浓度（1～2 mg/L）下，C0424基本上能够适应，SOD、POD值与对照差别不大，而CAT稍微高于对照，这说明CAT在C0424适应低浓度Cd环境中起到了重要的作用；而A0104则表现为另一种情况，当Cd浓度为1～2 mg/L时，SOD、POD活性上升，与对照差异显著，说明低浓度的Cd对A0104品种造成了一定的危害，激活了植株体内的氧化应激反应来对抗外界的Cd胁迫；当Cd浓度增加至3～4 mg/L时，C0424体内SOD、POD活性急剧上升，CAT活性明显降低，说明高浓度的Cd抑制了C0424体内的CAT活性，从而使植株无法及时清除体内的活性氧自由基，导致SOD和POD活性的升高，氧化应激加剧。因此，在芒属植物苗期Cd耐性方面，C0424要优于A0104。

[1] 邢艳帅，乔冬梅，朱桂芬，等. 土壤重金属污染及植物修复技术研究进展[J]. 中国农学通报，2014，30（17）：208-214.

[2] 陈 靖，林振景，孟媛媛，等. 土壤重金属污染的植物修复及超富集植物的研究进展[J].中国环境管理干部学院学报，2011，21（1）：69-71.

[3] 林 聪. 芒属能源植物耐盐性坚定与评价[D]. 长沙：湖南农业大学，2012.

[4] Wójcik M，Tukiendorf A. Glutathione in adaptation of Arabidopsis thaliana to cadmium stress[J]. Biologia Plantarum，2011，55（1）：125-132.

[5] Boominathan R，Doran P M. Organic acid complexation，heavy metal distribution and the effect of ATPase inhibition in hairy roots of hyperaccumulator plant species[J]. Journal of Biotechnology，2003，101（2）：131-146.

[6] 吴 琦，季 辉，张卫建. 土壤铅和镉胁迫对空心菜生长及抗氧化酶系统的影响[J]. 中国农业科学导报，2010，（2）：12-27.

[7] 杨卫东，陈益泰. 镉胁迫对旱柳细胞膜透性和抗氧化酶活性的影响[J]. 西北植物学报，2008，（6）：46-50.

[8] 陆晓怡，何池全. 蓖麻对重金属Cd的耐性与吸收积累研究[J]. 农业环境科学学报，2005，24（4）：674-677.

[9] 刘家女，周启星，孙 挺. Cd-Pb复合污染条件下3种花卉植物的生长反应及超积累特性研究[J]. 环境科学学报，2006，（12）：39-44.

[10] 尹永强，胡建斌，邓明军. 植物叶片抗氧化系统及其对逆境胁迫的响应研究进展[J]. 植物生理科学，2007，（27）：105-107.

（责任编辑：成 平）

Effects of Cadmium Stress on Antioxidant Enzyme System in Leaves of Two Species of Miscanthus

HUANG Xiang-ji，YANG You-cai

（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

Taking seedlings of Miscanthus A0104 and C0424 as materials, the effects of Cd stress on the antioxidant enzyme system of the leaves of Miscanthus was studied by means of hydroponics. The results showed that 1-2 mg/L Cd have less effect on the C0424 Cd stress, but when the concentration of Cd increased to 3- 4 mg/L, Oxidative stress increased in C0424 oxidative stress. And strong oxidative stress reaction happened in A0104 under 1- 4 mg/L Cd stress concentrations. It was concluded that the tolerance to Cd in C0424 is stronger than that in A0104.

Cd stress; antioxidant system; Miscanthus

Q945.78

A

1006-060X（2017）04-0039-04

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.011

2016-12-13

湖南省农业委员会2016年湖南重金属污染耕地修复及农作物种植结构调整试点资金专项（湘财农指〔2016〕130号）

黄湘吉（1989-），男，湖南张家界市人，硕士研究生，研究方向农业生态学。

杨友才