菰均一化全长cDNA 文库的构建

臧 剑，颜育民，张志刚，邹世湘，彭 琼

（1.广东菰稻农业有限公司，广东 广州 511400；2.湖南杂交水稻研究中心，湖南 长沙410125；3.湖南旺湘隆农业有限公司，湖南 长沙 410125；4.湖南省农业生物技术研究中心，湖南 长沙 410125）

菰均一化全长cDNA 文库的构建

臧 剑1，颜育民2，张志刚2，邹世湘3，彭 琼4

（1.广东菰稻农业有限公司，广东 广州 511400；2.湖南杂交水稻研究中心，湖南 长沙410125；3.湖南旺湘隆农业有限公司，湖南 长沙 410125；4.湖南省农业生物技术研究中心，湖南 长沙 410125）

为了获得国家二级保护植物品种菰的功能基因信息，并克隆功能基因片段，研究以SMART（switching mechanism at 5 end of RNA transcript）方式合成菰全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建菰叶片组织的均一化全长cDNA文库。该cDNA文库库容量大，达到了3.6×106PFU/mL，插入片段平均长度为1 000 bp，重组率为97.9%。均一化全长cDNA文库能有效富集低丰度表达基因，降低冗余率，适用于目的基因的筛选，以及后续的基因、蛋白互作分析。

菰；均一化；cDNA文库；功能基因

菰（Zizania latifolia （Griseb.） Stapf）即茭白，为多年水生禾本科植物，国家二级保护植物品种，也是水稻的近缘属。菰米是菰的颖果，又称茭米、黑米、雕胡米、雕菰、茭白子[1]。由于生物量大、抗病虫害能力强、耐寒性好等优良性状，近年来被专家学者用作水稻遗传育种优良基因资源库的重要来源之一[2]。然而，针对菰的分子生物学研究仍然处于起步阶段，菰的遗传信息尚未完全获知，这严重阻碍了其作为水稻育种优良基因资源库的应用。

构建cDNA文库是功能基因组学研究的基本手段之一，在研究某类特定细胞基因组表达状态及基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，在动植物的个体发育及细胞周期调控（细胞分化、细胞衰老和凋亡）等生命进程的研究中具有更为广泛的应用价值[3]。然而，以常规方法构建的cDNA文库通常面临着高通量分析过程中重复拷贝比例高这一问题，对基因的筛选和鉴定造成不必要的浪费[4]。研究表明，这一问题主要是因为高等真核生物的细胞中基因表达水平差异较大引起的。

为了克服基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来的障碍，人们试图在文库测序前就降低高丰度转录本的克隆，增加中、低丰度转录本出现的频率，以有利于低丰度表达基因的发现[5]。因此，均一化cDNA文库便应运而生。目前，主要有2种观点来构建均一化cDNA文库[6]。一种是以复性动力学为原理。通常，高丰度cDNA在退火下复性速度快，而低丰度cDNA复性需要较长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种则认为基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，那么通过cDNA和DNA的饱和杂交就可以降低文库中高拷贝存在的cDNA丰度，从而降低高丰度转录本的克隆。自1990年首次报道均一化cDNA文库以来，各种构建方法便层出不穷，目前该技术已日趋完善，市场上也有各种试剂盒以供选择。

该研究以菰幼嫩的叶片组织为试验材料，采用双链特异性核酸酶（DSN）酶切的均一化技术并结合SMART技术构建叶片的均一化全长cDNA文库，并从中挑取阳性克隆进行测序及生物信息学分析，该方法不仅能解决常规操作步骤复杂、RNA容易降解的问题，而且能够克服基因转录水平上的巨大差异，提高发现随机序列和稀有基因的几率，为菰新基因的发掘和功能基因组学的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料 供试材料菰取自湖南省沅江市洞庭湖区，选取生长状况良好的菰幼嫩叶片，迅速投入液氮，存于-70℃ 超低温冰箱备用。

1.1.2 主要试剂 Plant RNA提取试剂盒Tiangen（北京）、凝胶回收试剂盒（PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit）、SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech，634901）、QIA quick PCR Purification Kit（Qiagen，28104）、Advantage 2 Polymerase Mix（Clontech，639201）、Duplex-Specific Natlax（Evrogen，EA003）、Sfi I（NEB，R0123L）、DL2000 Marker（TaKaRa，D501A）。

1.2 试验方法

1.2.1 菰总RNA获得 使用Plant RNA（Tiangen，北京）提取试剂盒提取菰幼嫩叶片的RNA。

1.2.2 双链全长cDNA的合成 使用SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech，Cat. No.634901）试剂盒（5′和3′端均带有特异引物的全长cDNA）合成第1链。使用CDS III/3'引物和特异引物5'引物（5'-AAG CAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'），通过LD-PCR（long distance polymerasechain reaction）反应合成双链全长cDNA，纯化后用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.3 蛋白酶K消化 蛋白酶K消化参照郑鸿昌等[7]的方法，加入25 μL去离子水溶解沉淀，最后取5 μL样品进行电泳检测。

1.2.4 cDNA文库均一化 （1）杂交。将已纯化的双链cDNA加入0.2 mL PCR管中与杂交试剂混匀，而后分为4等分置于PCR管中。反应体系（16 μL）：ds cDNA (1 μg) 8 μL；2×Hybridization buffe 8 μL。反应条件：98℃预处理2 min，然后迅速转入68℃中杂交5 h。（2）DSN消化。反应体系（10 μL）：杂交后的cDNA 4 μL；2×DSN master buffer（68℃预热）5 μL；DSN solution（含DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control）1 μL。反应条件：68℃反应 25 min后；加入10 μL 2×DSN stop buffer室温放置5 min终止反应，-20℃保存。（3）两次PCR放大。cDNA均一化后，参照蒋敏等[8]的方法进行两次PCR的放大处理。取5 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5 cDNA文库构建 （1）酶切消化。反应体系（100 μL）：ds cDNA（2 g）79 μL；10×Sfi Buffer 10 μL；Sfi I酶10 μL；100×BSA 1 μL。反应条件：50℃温浴2 h进行sfi I酶切消化。（2）质粒转化。纯化酶切cDNA后，T4 DNA连接酶与适量的pUC19改造载体于4℃下连接过夜进行质粒转化，此时即为初始均一化全长cDNA文库。（3）文库放大。为了放大文库的质量，挑选24个克隆，37℃，200 r/min培养过夜，利用M13正反向引物进行菌落PCR扩增。反应体系（25 μL）：ddH2O 19.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；50×dNTP Mix 0.5 μL；M13F引物 0.5 μL；M13R引物 0.5 μL；rTag酶 0.5 μL；PCR模板1 μL。反应程序：94℃ 3 min； 94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min；36个循环；72℃ 5 min。从各管中分别取5 μL PCR产物进行电泳检测。

1.2.6 均一化效率验证 取200 μL菌液涂布于15 cm培养皿上（Apr-IPTG/x-gal LB固体培养基），观察记录菌落总数，按照“重组率（%）=（菌落总数-蓝斑总数）/菌落总数×100”的公式计算重组率。按照公式“文库容量=克隆数/涂板体积×稀释倍数×重组液体积”计算文库容量。式中，涂板体积为0.2 mL，稀释倍数为10，重组液体积为30 mL。参照高山等[9]的方法，以1/2 DSN和control为模板，利用用18S管家基因进行PCR检测，经Tanon GIS软件分析灰度后，验证cDNA文库的均一化效率。

2 结果与分析

2.1 cDNA 质量鉴定

如图1所示，反转录后cDNA 呈现均匀的弥散带，大小分布在750～2 000 bp，符合植物双链cDNA 长度。弥散带的亮度代表菰叶片中的RNA 成分具有多样性和复杂性。试验中合成的cDNA 质量较高，可以进行下一步试验。

图1 菰叶片cDNA 电泳图

2.2 均一化处理cDNA及效果分析

未经过均一化处理的传统cDNA文库具有高丰度转录基因克隆数目过多的缺点[10]。在该研究中，与对照相比，cDNA经过3个不同浓度DSN的均一化处理后在第一次PCR扩增时发现，1/4DSN均一化处理后，PCR产物中间较亮的条带消失明显，呈现一条均匀的弥散条带（图2A），表明高丰度表达基因的丰度呈现出明显下降的趋势。因此，选择1/4DSN的cDNA进行第2次PCR放大。检测结果同样显示扩增条带均匀弥散，扩增产物有所增加（图2B），可以用于建库。

2.3 cDNA文库质量分析

重组菌涂布试验结果显示，菌落总数为2 440个，其中蓝斑50个，即：重组率=（2 440-50）/2 440=97.9%，具有较高的重组效率。通过计算得出文库容量为3.6×106PFU/mL。随机挑取24个阳性克隆，用插入位点两侧引物进行菌落PCR扩增电泳检测，发现插入片段大多＞750 bp，平均大小为1 000 bp（图3）。以1/2 DSN和对照为模板，用18S管家基因进行PCR，产物经电泳后用Tanon GIS软件分析灰度，结果显示该cDNA文库均一化后比非均一化的丰度下降26 倍以上（图4）。

图2 DNS消化cDNA后第1次PCR放大检测（A）和第2次PCR放大检测（B）

图3 随机挑取24个阳性克隆进行插入片段的PCR检测

图4 均一化效率验证

3 讨 论

构建cDNA文库是获得研究对象基因序列信息的有效方法之一，可为新基因的发掘、功能基因的鉴定提供高效、便捷的途径。经典的cDNA文库构建往往所需时间较长、克隆的片段较短，不能提供完整的mRNA信息，而均一化的cDNA文库能增加低丰度mRNA的表达机会。

重组率、库容量、插入片段大小及均一化效果等是对均一化cDNA文库构建质量的主要评价指标[11]。该研究获得的原始文库容量为3.6×106PFU/mL，保证了文库的完整性与覆盖度。插入片段平均长度为1 000 bp，重组率为97.9%，均一化全长cDNA文库能有效富集低丰度表达基因，降低冗余率。研究结果表明，该文库是一个高质量的全长均一化cDNA文库。该方法构建的文库不仅为功能基因的验证奠定了基础，而且为进一步发掘和利用菰自身有利基因打下了基础。

[1] 金增辉. 菰米的营养化学与开发利用[J]. 粮食加工，2016，41（1）：58-61.

[2] 沈玮玮，宋成丽，陈 洁，等. 转菰候选基因克隆获得抗白叶枯病水稻植株[J]. 中国水稻科学，2010，24（5）：447-452.

[3] 迟吉娜，蔡 肖，张建宏，等. 冀228 纤维均一化全长cDNA 文库的构建与鉴定分析[J].中国农业科学，2016，49（5）：813-824.

[4] 余海洋，张 宇，王 萌，等. 巴西橡胶树胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库构建[J]. 植物生理学报，2016，52（3）：312-316.

[5] 晏慧君，黄兴奇，程在全. cDNA文库构建策略及其分析研究进展[J]. 云南农业大学学报，2006，（1）：1-6.

[6] Zhang Z Q，Xiao G，Tan T L，et al. Advances in normalized cDNA library and its applications[J]. Agricultural Science＆Technology，2010，（4）：1-5，43.

[7] 郑鸿昌，刘 涛，吕恃衡，等. 夜香树均一化全长cDNA文库的构建及EST分析[J]. 热带亚热带植物学报，2016，24（1）：40-49.

[8] 蒋 敏，王 江，文国松，等. 铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建和序列分析[J]. 中国中药杂志，2013，38（4）：504-510.

[9] 高 山，陈桂信，许端祥，等. 成熟软化期苦瓜果实均一化全长cDNA文库的构建与EST分析[J]. 分子植物育种，2013，11（2）：211-216

[10] 禹山林，迟晓元，杨庆利，等. 花生幼苗全长cDNA文库的构建[J].花生学报，2010，39（2）：11-15.

[11] 李 晨，闫晓红，周新安，等. 大豆种子不同发育时期全长均一化cDNA 文库的构建[J]. 中国农业科学，2010，43（3）：462-467.

（责任编辑：成 平）

Establishment of a Normalized Full-Length cDNA Library of Zizania latifolia

ZANG Jian1，YAN Yu-min2，ZHANG Zhi-gang2，ZOU Shi-xiang3，PENG Qiong4
（1. Guangdong Gudao Agricultural Limited Company, Guangzhou 511400, PRC; 2. Hunan Hybrid Rice Research Center, Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Wangxianglong Agricultural Limited Company, Changsha 410125, PRC; 4. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center, Changsha 410125, PRC）

In order to obtain functional genes, a narmalized stems cDNA library was constructed from precious plant Zizania latifolia (Griseb.) Stapf. SMART (switching mechanism at 5 end of RNA transcript) cDNA synthesis combined with DSN (duplex-specific, nuclease) normalization was applied to construct the normalized full-length cDNA library of Z. latifolia. The titer of cDNA library was about 3.6×106PFU/mL and the average insertion size was about 1.0 kb with high recombination rate (97.9%). Homogenization full-length cDNA library enrichment of low abundance is suitable for the purpose of gene selection and subsequent analysis of the gene and protein interactions, for expressing genes effectively and reducing the redundancy rate.

Zizania latifolia; normalization; cDNA library; functional gene

Q943.2

A

1006-060X（2017）04-0011-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.003

2017-02-08

湖南农业科技创新资金（2016QN08）

臧 剑（1972-），男，湖南沅江市人，工程师，主要从事水稻育种研究。

彭 琼