二甲双胍抗肿瘤血管及抑制胃癌细胞生长的实验研究

徐晨，胡家平，李太原

（南昌大学第一附属医院普外科，江西南昌330006）

二甲双胍抗肿瘤血管及抑制胃癌细胞生长的实验研究

徐晨，胡家平，李太原

（南昌大学第一附属医院普外科，江西南昌330006）

目的探讨二甲双胍抗肿瘤血管及抑制胃癌细胞生长的实验研究。方法应用Traswel l侵袭试验以及Matr igel血管状结构形成实验研究二甲双胍对于血管内皮细胞的侵袭以及血管状结构形成的作用；应用胃癌细胞BGC823MTT试验和Annexin-V细胞凋亡试验明确二甲双胍在抑制为癌细胞生长方面的影响。结果二甲双胍可显著抑制肿瘤血管的侵袭以及血管状结构的形成，并能抑制胃癌细胞BGC823的增殖，诱导其凋亡，其中10 mmol/L二甲双胍的凋亡率高达60%。结论二甲双胍具有抗肿瘤血管及抑制胃癌细胞生长作用，并能促使胃癌细胞凋亡，发挥其抗肿瘤作用。

二甲双胍；抗肿瘤血管；抑制胃癌细胞生长

二甲双胍，属于双胍类降血糖药物，可减少患者肝脏糖异生，并促使肌肉组织与脂肪摄取葡萄糖，实现降血糖目标[1]。而近几年来，已经有大量临床实验证明二甲双胍不但是良好的降血糖药物，还可抑制肺癌、肝癌、肾癌以及乳腺癌生长。同时，亦有文献证实二甲双胍可诱导肿瘤细胞凋亡[2]。本研究为明确二甲双胍抗肿瘤血管及抑制胃癌细胞生长作用，通过各项试验予以研究，现将试验结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂选取北京协和细胞库提供的胃癌细胞BGC823，Singma公司提供的二甲双胍、结晶紫染液和MTT，Mi l lipore公司提供的Transwel l小室，Mbchem公司提供的AV/PI双染凋亡检测试剂盒以及BD公司提供的Matr igel胶，美国ScienCel l公司提供的ECM培养基和HUVEC。

1.2 试验方法

1.2.1 胃癌细胞Traswel l侵袭试验制作人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）悬液，将细胞浓度控制在2.5×105个/mL，取100μL细胞悬液置入Transwel l上层小室内，并将ECM培养基600 L置入下层。细胞固定好后，将5 mmol/L、10 mmol/ L二甲双胍培养基100μL置入，并设定空白对照组。培养细胞1 d后取出小室，使用PBS进行彻底清洗，再应用4%的多聚甲醛进行20 min固定处理，再使用结晶紫染液进行10 min的染色，擦拭干净上室中细胞，在显微镜下进行图像采集，评估二甲双胍对于血管内皮细胞的侵袭。

1.2.2 Mat rigel血管状结构形成实验把Mat rigel基质胶置放于4℃环境下进行解冻，并均匀铺散在96孔的细胞培养板中。将培养板放在37℃的培养箱内孵育0.5 h，使用浓度为2×105个/mL的HUVEC悬浮细胞加入培养板，每个孔均为100μL。细胞固定好后，将5 mmol/L、10 mmol/L二甲双胍培养基100μL置入，并设定空白对照组。继续在孵育箱内培养，12 h后在显微镜下观察其微管形成状况。

1.2.3 胃癌细胞BGC823MTT试验对胃癌细胞BGC823进行离心处理，除去培养基后使用新鲜的培养基予以重悬，使用5×103个/孔与96孔板进行接种。培养1 d后分别置入0 mmol/L、5.0 mmol/L、20.0 mmol/L、60.0 mmol/L二甲双胍，在37℃环境下培养3d后去除培养基，在每个孔中置入20μL含有5 mg/mL的MTT无血清培养基，在37℃环境下完成4 h的孵育，离心15 min后取出上清，置入200μL的DMSO，振荡10 min后使用酶标仪检查其波长，测定OD值。

1.2.4 Annexin-V细胞凋亡试验将胃癌细胞BGC823分别在5 mmol/L、10 mmol/L二甲双胍内暴露1d后，给予离心处理并除去培养基，再使用PBS清洗2次，置入Annexin-V2μL和Binding Buf fer100μL，避光0.5 h后加入PI4μL，反应5 min后置入Binding Buf fer400μL。使用流式细胞仪检查其细胞凋亡状况。

2 结果

2.1 二甲双胍对于HUVEC细胞侵袭影响相较于空白对照组，5 mmol/L、10 mmol/L二甲双胍均可抑制HUVEC细胞侵袭能力。见图1。

图1 二甲双胍抑制HUVEC细胞侵蚀的作用

2.2 二甲双胍对于HUVEC细胞血管状结构形成的作用因为HUVEC细胞可于体外Matrigel形成血管状结构，并模拟正常人体中毛细血管的生成过程。因而本研究通过观察HUVEC细胞于Mat rigel胶中形成的血管样结构评估二甲双胍对于血管形成的作用。结果显示，5 mmol/L、10 mmol/L二甲双胍均可抑制内皮细胞形成血管状结构。见图2。

图2 二甲双胍对于HUVEC细胞血管状结构形成的作用

2.3 二甲双胍抑制胃癌BGC823细胞增殖的作用应用MTT试验检测各组细胞OD值，公式如下：抑制率=对照组OD值与给药组OD值差值/对照组OD值×100%，计算各组浓度抑制率：0 mmol/L二甲双胍（空白对照组）=0；5.0 mmol/L二甲双胍=13.15%；20.0 mmol/L二甲双胍=48.93%；60.0 mmol/L二甲双胍=68.84%。

2.4 二甲双胍促胃癌BGC823细胞凋亡的作用经Annexin-V/PI实验结果显示，二甲双胍能够促使胃癌BGC823细胞凋亡，并具有浓度依赖性，其中10 mmol/L二甲双胍组的凋亡比例大约为60.0%。

3 讨论

二甲双胍具备抗肿瘤多样生物活性，据临床研究已经证实，二甲双胍能够抑制结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤和肾癌等恶性肿瘤生长，然而在抑制胃癌生长方面的作用机制尚未明确[3]。经临床试验发现，二甲双胍对肿瘤血管新生有抑制作用[4]，因而本研究使用HUVEC研究二甲双胍对于肿瘤血管侵袭的干预作用。结果显示，二甲双胍可显著抑制HUVEC侵袭。因为Mat r igel血管状结构形成试验可模拟正常人体中肿瘤血管生成过程，因而本研究搭建HUVEC血管状结构的形成模型，结果显示二甲双胍能够抑制HUVEC血管样结构形成，印证了二甲双胍对于肿瘤血管形成的抑制作用。

另外，既往研究结果显示，二甲双胍对于肿瘤细胞有直接作用，能够抑制其增殖，并诱导其凋亡，最终实现对肿瘤细胞生长的抑制作用[5]。比如，有学者经研究证实二甲双胍可激活肿瘤细胞中AMPK，发挥对乳腺癌增殖的抑制性作用，也可诱导卵巢癌细胞的凋亡。同时，还有研究人员表示二甲双胍能够抑制结肠癌细胞表达，增加Bax表达，发挥其促癌细胞凋亡的作用[6]。然而，对于胃癌研究尚未明确，所以本组研究通过MTT实验发现，二甲双胍对对于胃癌BGC823细胞增殖有抑制作用，最大抑制率约60%。而nnexin-V/PI流式凋亡检验结果显示，二甲双胍可促使胃癌BGC823细胞凋亡。

综上所述，作为糖尿病一线药物的二甲双胍对于肿瘤多类生物活性，已经备受研究者关注。据本组研究结果可知，二甲双胍对于肿瘤血管形成具有较强的抑制性作用，同时还可直接作用在胃癌细胞上，在抑制其增殖的同时诱导其凋亡，从而发挥其胃癌的积极作用。

参考文献

[1]魏德强，王冰，王烈.二甲双胍对胃癌细胞株增生及Cycl in D1表达的影响[J].国际外科学杂志，2010，37（3）：171-174.

[2]薛知新，钟捷，赵丹瑜，等.二甲双胍对AGS胃癌细胞生长侵袭的抑制作用[J].世界华人消化杂，2010，18（19）：1974-1978.

[3]薛知新，赵丹瑜，许慈，等.二甲双胍对人胃癌细胞株MKN45增殖和迁徙的影响[J].胃肠病学，2010，15（5）：280-283.

[4]谢颖，赖晓阳.二甲双胍及甘精胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响[J].中国糖尿病杂志，2014，22（6）：556-559.

[5]李鹏，刘江伟，韩振魁，等.二甲双胍对人胰腺癌细胞增殖与凋亡的影响及其分子机制的研究[J].中华肝胆外科杂志，2012，18（12）：933-937.

[6]贺志龙，夏伟，冯璜，等.二甲双胍对人胰腺癌细胞株CFPAC-1增殖与凋亡的影响[J].中华胰腺病杂志，2014，14（3）：181-184.

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.05.054