产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定

吴自祥，万学瑞,马亚茹，王 艳，吴 润，王 川，魏 姣，刘 磊，张小丽，张天亮，杨润霞，贾晓蕊

(甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070)

产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定

吴自祥，万学瑞,马亚茹，王 艳，吴 润，王 川，魏 姣，刘 磊，张小丽，张天亮，杨润霞，贾晓蕊

(甘肃农业大学 动物医学学院，甘肃 兰州 730070)

通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株，为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料。采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株，以DNS法测定酶活，根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株；观察分离菌株的形态、染色与培养特性；应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA，测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索，作出复筛菌株种的鉴定。结果表明：分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株，均为革兰氏阳性菌，菌体呈短杆状、具中央芽孢，经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索，鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

纤维素酶；16S rDNA；分离；鉴定；枯草芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌

随着世界经济的快速发展，能源需求量急剧上升，为了实现可持续发展，世界各国均在寻求新的替代能源，如风能、核能、太阳能、生物质能等等。在各种新型的替代能源中，纤维素燃料乙醇是公认的最具有发展前景的能源。地球上每年光合作用可产生大于50亿t以上的纤维素和半纤维素[1]，纤维素物质是地球上分布最为广泛、含量最为丰富的碳水化合物[2]。利用现代生物技术将纤维素转化为乙醇等液体燃料，有希望解决能源危机、环境污染和粮食危机等问题[3]，此外还可以实现对农业产品剩余价值的高效利用。以纤维素作为原料生产乙醇，产量稳定、可再生和无污染，但目前利用纤维素物质生产乙醇的成本很高，缺少具有商业应用价值的高效酶制剂。因此，开发新的高活性纤维素酶酶制剂成为人们关注的热点，选育纤维素酶高产菌株尤为重要。目前对纤维素酶产生菌的研究多集中在真菌，以木霉属、青霉属和曲霉属更为常见，而对细菌的报道较少。近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉纺织品的水洗工艺和洗涤剂中的成功应用，细菌纤维素酶酶制剂也显示出良好的应用前景[4]。从兰州市周边村庄植物秸秆、牛羊粪便、枯枝败叶中筛选高产纤维素酶细菌菌株，进行分离菌株表型特性和16S rDNA序列鉴定及其酶学研究，以期获得纤维素酶高产菌株，为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌株构建提供试验材料基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品 用无菌法从兰州市安宁区黄家滩附近采集腐败植物秸秆、碎木屑、牛羊粪便及枯枝落叶及土壤等10份样品，供纤维素酶产生细菌菌株分离。

1.1.2 试剂 葡萄糖、刚果红、3,5-二硝基水杨酸等常规试剂均为国产分析纯；溶菌酶、细菌基因组总DNA提取试剂盒购于BioTeke公司；Taq酶购于康润生物科技公司；PCR产物回收试剂盒购于OMEGA公司。

1.1.3 培养基 初筛和复筛培养基按文献[5]配方和方法进行配制。

初筛培养基 CMC-Na 10 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨1 g，酵母膏0.5 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1 000 mL，自然pH。

产酶培养基 CMC-Na 10 g，蛋白胨 10 g，酵母膏 5 g，NaCl 1 g，KH2PO41 g，MgSO40.2 g，蒸馏水定容至1 000 mL，自然pH。

马铃薯培养基 马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，1 000 mL蒸馏水。马铃薯切片，加水煮沸30 min，纱布过滤，加葡萄糖、琼脂，滤液补足1 000 mL，121℃灭菌备用。

1.2 方法

1.2.1 样品处理 称取样品25 g，加入到盛有225 mL无菌生理盐水的三角瓶中，将样品充分打散混匀，置于37℃恒温摇床摇动2 d备用。

立体仓库巷道两侧为一组货架，货架位置固定、大小一致，每个货位最多存放一件货物。巷道两端各有一个出/入库台，同一巷道上设置两台堆垛机同时进行拣选作业，各自从其对应的出/入库台执行存/取任务。两台堆垛机性能一致，最多承载一个货物。立体仓库实例仿真基本参数如表1所示。

1.2.2 初筛 用无菌生理盐水稀释样品溶液，取10-1～10-33个稀释度各0.1 mL样液分别涂布于初筛培养基平板，每个稀释度涂3个平板，28℃培养2 d。选择长势良好的单菌落点种于初筛培养基平板，28℃培养2 d，用1 mg/mL的刚果红染色液染色30 min，再用1 mmol/L NaCl溶液脱色2遍。若菌株产生纤维素酶，在菌落周围会出现清晰的透明水解圈，挑选菌落周围有明显透明圈的菌株继续进行纯化与复筛。

1.2.3 纯化与复筛 将初筛选出的菌株在马铃薯培养基上进行划线，再挑取单菌落点种于初筛培养基，经刚果红染色仍能产生水解圈者，进行革兰氏染色与镜检，观察其染色特性和形态特征均一性。重复上述试验，确保获得分离菌株的纯培养物。根据水解圈直径/菌落直径的比值大小，选出纤维素酶酶活相对较高的菌株，移置培养基斜面于28℃培养1～2 d，置普通冰箱保存备用。

1.2.4 分离菌株形态与染色及菌落形态观察 将复筛出的分离菌株划线接种于马铃薯培养基平板，置28℃培养1～2 d，观察菌落形态。挑取菌落抹片、革兰氏染色与镜检，观察分离菌株菌体形态与染色特性。

1.2.5 分离菌株的16S rDNA序列分析与鉴定 参照文献[6]方法进行，进行各复筛菌株16S rDNA的扩增、测序及序列比对分析，作分离菌株种的鉴定。

(1)菌株基因组总DNA提取 将待鉴定菌株分别接种马铃薯液体培养基，置28℃转速200 r/min摇床培养72～96 h，用细菌基因组总DNA提取试剂盒按其操作说明分别提取各菌株基因组总DNA，置-20℃保存备用；(2)菌株16S rDNA序列扩增与测序 设计并合成16S rDNA扩增通用引物。上游引物 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物 5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，由上海生工公司合成。

以提取的菌株基因组总DNA为模板，分别进行各菌株的16S rDNA序列扩增。PCR扩增体系(50 μL)：模板DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，Taq预混酶(TaKaRa)25 μL，水19 μL。PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃45 s、55℃45 s、72℃1 min，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃终止反应。取PCR扩增产物4 μL作1%琼脂糖凝胶电泳检测。若扩增产物大小与预期结果相符，将扩增产物纯化后送上海生工公司测序；(3)菌株16S rDNA序列分析与菌株鉴定 提交各菌株16S rDNA序列于GenBank数据库，经Blast相似性搜索，获取相近典型菌株的基因序列，作出各分离菌株种的鉴定。

1.2.6 分离菌株产纤维素酶性质鉴定 将鉴定出的菌株接种于装有50 mL产酶培养基容量为250 mL的锥形瓶中，28℃转速200 r/min摇床培养5 d，然后4 000 r/min离心10 min收集上清液，得粗酶液。取0.5 mL粗酶液，分别以滤纸、CMC-Na[7]，Avicel[8]和水杨苷[9]作为底物，用DNS方法[10]确定各菌株产酶性质并测定内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶酶活，通过Spss软件处理酶活数据。

2 结果与分析

10份样品处理液涂布于初筛培养基分离培养，选择单菌落点种初筛培养基平板再培养后，用刚果红染色观察。有86个菌落周围有明显水解圈，均为细菌菌落，且菌落较大，直径在10～20 mm。

2.2 菌株复筛

进行划线纯化培养，共获得86株产纤维素酶细菌菌株。再进行各菌株的产酶复筛试验，根据水解圈直径/菌落直径之比，筛选出16株相对酶活较高的菌株(表1)。

2.3 菌落形态及个体形态

复筛分离株菌落呈乳白色或肉粉色，直径10～20 mm，大小不等，形状不一，多数扁平，边缘有的整齐、有的呈放射状或裂叶状，表面有的湿润且粘稠、有的表面干燥且有皱褶。革兰氏染色均为阳性，多数菌株菌体呈短杆状，中间有芽孢生成，芽孢不大于菌体横径。

表1 16株产纤维素酶细菌水解圈与 菌落直径比较Table 1 Hydrolysis circle and colony diameter of 16 cellulase producing strains

2.4 菌株16S rDNA鉴定结果

试验以总DNA为模板，用16S rDNA通用引物进行PCR扩增其16SrDNA片段，得到大小1 500 bp

的DNA片段(图1)。经各菌株16S rDNA序列在GenBank中作同源性检索分析，16株分离菌16S rDNA序列与GenBank中已注册参考菌株的16S rDNA序列同源性均高于99%，可鉴定为10株枯草芽孢杆菌、6株解淀粉芽孢杆菌(表2)。用DNA Star生成系统发育进化树(图2)。

图1 部分菌株16S rDNA PCR扩增Fig.1 The results of 16S rDNA PCR amplification of some strains注：1～4.16S rDNA的PCR扩增产物；M.2 000 bp DNA 分子质量标准

顺序菌株编号参考菌株16SrDNA序列号同源性/%鉴定结果AC-3HQ143563.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BB-3KM226924.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CG-2JX316756.199解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DB-1KF496886.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)ED-2KM488323.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)FH-3KF954553.199解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GH-1GQ853414.199解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HA-1GQ861468.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)IB-5KF001839.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)JH-2KJ149810.199解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)KB-7JQ695930.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)LC-2HM055602.199枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)MJ-1JQ346075.1100枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)NL-3GU323369.199解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)OK-2KM365462.1100枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PM-1HM055603.199解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)

2.5 菌株产纤维素酶性质的鉴定

用DNS方法测定16株分离菌的3种纤维素酶酶活，并通过SPSS软件处理酶活数据，1株细菌具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶3种纤维素酶活性，5株细菌具有内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶两种酶活性，2株菌具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶两种酶活性，8株细菌仅具有内切葡聚糖酶活性(表3)。

表3 产纤维素酶菌株酶活Table 3 The activity of cellulase producing strains U/mL-1

注：“-”表示无酶活

图2 16株菌的16S rDNA系统发育树Fig.2 Phylogenctic tree of 16S rDNA of 16 strans

3 讨论

地球上可以分解纤维素的微生物种类繁多，有真菌、细菌、放线菌等[11]。细菌所产生的纤维素酶最适pH为中性至偏碱性，因其水解纤维素作用较弱，长期以来没有得到足够的重视。但是，从环境保护和动物营养等方面来看，对厌氧菌或兼性厌氧菌的研究尤为重要，因为污物纤维素类的分解及饲料发酵加工等大都在缺氧环境下进行，真菌则处于弱势地位。并且，细菌纤维素酶对酸碱耐受性强，最适反应温度范围广，耐高温，更有利于工业生产。

试验用刚果红染色法筛选产纤维素酶的菌，方法简单快速，通过水解圈直径与菌落直径之比能直接反应该菌产纤维素的能力，其原理是刚果红能与大分子多糖结合[12]。应用16S rDNA序列分析的分子生物学技术并结合形态学观察，能够快速准确地对菌株种属进行鉴定。采用DNS方法测定菌株酶活，此方法操作简便，但其存在一定误差，可以对菌株之间的酶活相对高低进行比较，为筛选高酶活菌株提供理论依据。

研究所筛选出的16株菌均产芽孢，属于芽孢杆菌属，其中，枯草芽孢杆菌是目前研究最多的产纤维素酶细菌。试验分离出新的产纤维素酶菌株，细菌产纤维素酶的种类较少，并不是每一株细菌均能产生3种纤维素酶，这也是导致细菌纤维素酶活力较低的原因之一。分离出的解淀粉芽孢杆菌L-3，与国内报道的用相同方法筛选出的高酶活细菌菌株[13-16]相比较高，其中CMC酶活高达240.311 U/mL，且仍可进一步对其优化和诱导，提高其纤维素酶活力，具有相当广阔的理论价值和应用前景。

4 结论

此次研究共筛选出16株产纤维素酶的细菌，经鉴定均为芽孢杆菌属，10株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

[1] Leschine S B.Cellulose degradation in anaerobic environments[J].Annual Review of Microbiology,1995,49:399-426.

[2] Lynd L R,Wyman C E,Gerngross T U.Biocommodity engineering[J].Biotechnology Progress,1999,15(5):777-793.

[3] Wood B E,Ingram L O.Ethanol production from cellobiose,amorphous cellulose,and crystalline cellulose by recombinant Klebsiella oxytoca containing chromosomally integrated zymomonas mobilis genes for ethanol production and plasmids expressing thermostable cellulase genes from Clostridium thermocellum[J].Applied Environmental Microbiology,1992,58:2103-2110.

[4] 赵新刚.洗涤用碱性纤维素酶及其产生菌的分离方法[J].微生物学通报,1999,26(1):63-65.

[5] 顿宝庆,吴薇,王旭静,等.一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定[J].中国农业科技报道,2008,10(1):113-117.

[6] 郭大成.产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶条件的初步研究[D].郑州:郑州大学,2008：14-15.

[7] 马旭光,张宗舟,等.黑曲霉高产纤维素酶活突变株的筛选[J].中国酿造,2008,186:61-63.

[8] 李保深,高大文,张博.一株产纤维素酶真菌的筛选、鉴定及降解效果[J].东北林业大学学报,2011,39(7):134-137.

[9] 李华,高丽.β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展[J].食品与生物技术学报,2007,26(2):107-114.

[10] 赵亚华.生物化学实验室技术教程[M].广州:华南理工大学出版社,2000.

[11] 李明华,张大伟,楚杰,等.饲料纤维素酶的研究与应用进展[J].新饲料,2006(7):65-68.

[12] 刘海波,王义强,陈介南,等.一株高产纤维素酶菌的筛选与鉴定[J].生物学杂志,2005,25(3):16-20.

[13] 马中良,李莉,张阳奕,等.含纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶生物学性质的研究[J].药物生物技术,2009,16(1):043-045.

[14] 葛春辉,徐万里,邵华伟,等.一株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及其纤维素酶的部分特性[J].生物技术,2009,19(1):36-40.

[15] 吕静琳,黄爱玲,郑蓉,等.一株产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及产酶条件优化[J].生物技术,2009,19(16):26-29.

[16] 祝小,王振华,潘康成,等.产纤维素酶芽孢杆菌筛选及发酵条件的初步研究[J].现代农业科技,2006(11):122-124.

Isolation screening and identification of cellulase producing bacteria

WU Zi-xiang,WAN Xue-rui，MA Ya-ru，WANG Yan，WU Run，WANG Chuan，WEI Jiao，LIU Lei，ZHANG Xiao-li，ZHANG Tian-liang,YANG Run-xia，Jia Xiao-rui

(CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China)

In order to provide bacteria for development of cellulase preparations and cellulase engineering，the high-yield cellulase bacteria strains were screened.Separate cellulase producing strains isolated from cow or sheep dung and putrid maize straws or wood chips with Congo red plate to screen cellulase producing strains through the determination of enzyme activity with DNS assay,and observe its shape,dyeing and cultural characteristics.16S rDNA universal primers were applied to amplify genomic DNA of the strain,and to identify the species of rescreening strains.The result indicated that the isolated 16 bacterial strains with higher cellulase production were gram positive,short rod and central spores.In which,10 strains wereBacillussubtilis,6 strain wereBacillusamyloliquefaciens.

cellulase；16S rDNA；isolation；identification；Bacillussubtilis；Bacillusamyloliquefaciens

2016-09-08；

2016-11-02

甘肃省科技支撑计划项目(1204NKCA103)；甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目(GNSW.2012-25)；甘肃农业大学盛彤笙科技创新基金项目(GSAU-STS-1232)资助

吴自祥(1991-)，男，甘肃白银人，在读硕士研究生。 万学瑞(1979-)，女，甘肃白银人，副教授，博士，主要从事预防兽医学研究工作。对全文有同等贡献，并列第一作者。 E-mail：383921499@qq.com

Q 939.99

A

1009-5500(2017)02-0007-06

吴润为通讯作者。