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淫羊藿总黄酮对大鼠心肌急性缺血再灌注损伤氧化应激干预机制的研究

2017-05-17张卫萍邓杨阳任建勋李晶瑾陈涛

中国中药杂志 2016年18期

张卫萍+邓杨阳+任建勋+李晶瑾+陈涛+郜姗姗

[摘要]观察淫羊藿总黄酮对大鼠心肌急性缺血再灌注损伤氧化应激干预作用及其机制。40只雄性大鼠随机分为假手术组,模型组,地尔硫卓组(阳性对照药)以及淫羊藿总黄酮高、低剂量组,每组8只。淫羊藿总黄酮分别以200,100mg·kg-1的剂量连续灌胃给药4d后,结扎冠状动脉前降支40min再灌注4h建立大鼠急性心肌缺血再灌注损伤模型。采用N-BT染色法测定心肌梗死范围,比色法检测心肌组织中SOD和T-AOc活性及MDA含量,ELISA法测定血清TnI水平,同时光镜下观察心肌组织结构的变化,分别应用免疫组化和westem blot法观察心肌组织中SIRT1与Nrf2表达的变化。结果发现,与模型组比较,淫羊藿总黄酮高、低剂量组以及地尔硫卓组能明显减少心肌梗死范围,降低血清TnI水平,提高心肌组织中SOD和T-AOC活性并降低MDA含量(P<0.05或P<0.01),改善缺血再灌注损伤后心肌的组织结构,同时淫羊藿总黄酮高、低剂量组中心肌组织SIRT1和Nrf2表达明显增加(P<0.05或P<0.01)。由此可见,淫羊藿总黄酮能够通过提高机体SIRT1与Nrf2内源性抗氧化信号传导通路,增加心肌组织的抗过氧化能力,从而抑制心肌急性缺血再灌注过程中氧化应激反应导致的心肌细胞不可逆性伤害,维护心肌组织的正常功能。

[关键词]淫羊藿总黄酮;氧化應激;缺血再灌注损伤;干预机制

氧化应激(oxidative stress)反应是机体在各种损伤因素的刺激下,体内的活性分子包括活性氧自由基产生过多,超出机体对过氧化物的清除能力,破坏氧化与抗氧系统之间的平衡,从而造成机体组织的氧化损伤。心肌缺血再灌注是引起冠心病心肌损伤的重要病理机制,多见于冠心病溶栓、PCI治疗等过程中。而由心肌缺血再灌注过程中产生的大量的活性氧族(ROS)已被证实是再灌注损伤的重要机制。因此对心肌缺血再灌注损伤过程中氧化应激的干预是减轻心肌坏死或凋亡、保护心脏功能、改善预后的主要途径和药理作用靶点。淫羊藿总黄酮是中药淫羊藿的主要有效部位,对免疫、内分泌、心脑血管系统以及骨和肿瘤组织等具有多方面药理活性。尽管研究证实淫羊藿有效成分作为天然的抗氧化剂,能够明显改善大鼠心肌缺血再灌注后损伤,但是对其抗氧化作用的机制尚未深入研究。本研究旨在探讨淫羊藿总黄酮通过其抗氧化应激作用发挥对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护的机制。

1材料

1.1动物

健康雄性SD大鼠40只,SPF级,体重200~220g,斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供,合格证号SCXK(京)2011-0004。适应性喂养3d后开始实验。

1.2药物与试剂

淫羊藿总黄酮购自陕西惠科植物开发有限公司;盐酸地尔硫卓片(合心爽,50mg/片,批号1107050)购白天津田边制药有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20150810),丙二醛(MDA)试剂盒(批号20150810),总氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(批号20150508)购自南京建成生物工程研究所;大鼠肌钙蛋白(TnI)ELISIA测定试剂盒购自美国ANDYGENE公司;抗SIRT1小鼠单克隆抗体(abl04833),抗核因子相关因子2(Nrf2)大鼠单克隆抗体(ab89443)购自英国abeam公司;BCA蛋白测定试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司;超敏ECL化学发光试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

1.3仪器

DENLEY DRAGON Wellsean MK 3酶标仪(美国Thermo公司);Biofuge traetos低温高速离心机(德国Heraeus公司);蛋白垂直电泳系统(美国bio-rad公司);LEICA HM335E病理切片机LEICA[(德国)公司];Nikon 501光学显微镜[Nikon(日本)公司]。

2方法

2.1分组与给药

动物随机分为5组,每组8只,分别为假手术组(给予等体积生理盐水,5 mL·kg-1),模型组(给予等体积生理盐水,5 mL·kg-1),西药对照药地尔硫卓组(10 mg·kg-1),淫羊藿总黄酮高剂量组(200mg·kg-1),淫羊藿总黄酮低剂量组(100mg·kg-1)。以上各组采用的干预药物均以生理盐水配至所需浓度,给药体积为5 mL·kg-1,连续灌胃给药4d后,采用冠状动脉结扎法诱导大鼠心肌缺血再灌注模型。

2.2大鼠心肌缺血再灌注模型的建立

参考文献方法,大鼠以戊巴比妥钠腹腔麻醉(45 mg·kg-1)后,仰位插入气管插管,接动物呼吸机行人工呼吸;开胸后暴露心脏,撕开心包膜,在肺动脉圆锥和左心耳之间,于冠状动脉左前降支根部,即穿线(0号缝合线)待结扎用。待大鼠稳定10min后行冠状动脉左前降支结扎。结扎后心肌缺血的可靠性通过同步监测心电图Ⅱ肢体导联,表现为J点或ST段的抬高和T波改变,以及心脏表面由红润变为苍白。假手术组大鼠仅进行冠状动脉左前降支根部穿线,但不结扎。在冠状动脉左前降支结扎40min后剪断结扎线,实现再灌注过程,缝合胸壁,动物恢复自主呼吸。随后再灌注240min后结束试验。

2.3指标检测

2.3.1大鼠心肌梗死范围及测定心肌再灌注末,于心脏结扎线以下水平横切5片,进行N-BT染色,扫描后采用Image-pro plus图像分析系统,测量总心肌面积及梗死心肌面积。

2.3.2心肌组织中SOD和T-AOC活性及MDA含量的测定心肌再灌注末,于心脏结扎线下远心端1/3处取心肌组织,进行组织匀浆,4 000 r·min-1离心15min,取上清液,采用比色法测定心肌组织中MDA含量以及SOD和T-AOC活力,具体操作按试剂盒说明书进行。

2.3.3血清肌钙蛋白I(troponin I,TnI)的测定心肌再灌注末,经大鼠腹主动脉抽取全血3 mL,常温3000 r·min-1离心15min,取上清,采用ELISA法测定血清TnI水平,具体操作按试剂盒说明书进行。

2.3.4心肌组织病理学观察实验结束后,于心脏结扎线下近心端取心肌组织,10%甲醛固定,石蜡包埋后切片,苏木素.伊红(HE)染色,光镜下观察病理变化。

2.3.5心肌缺血远端组织SIRTl蛋白表达检测心肌再灌注结束后,于心脏结扎线下远心端1/3处取心肌组织,10%甲醛固定,石蜡包埋后切片、脱蜡。采用H2O2去除内源性过氧化物,将切片放入0.01mol·L-1枸橼酸缓冲液中进行微波修复。5%牛血清白蛋白(BSA)封闭20 min,加入抗SIRT1小鼠单克隆抗体(1:500)37℃孵育30 min。PBS充分漂洗后,依次滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG进行结合反应,DAB显色后苏木素复染,盐酸分化,脱水封片,进行镜下观察。利用IPP6.0图像分析系统进行图像分析,随机选择5个视野对阳性细胞进行平均灰度值测定。

2.3.6心肌缺血远端组织Nrf2蛋白表达检测心肌再灌注结束后,于心脏结扎线下远心端1/3处取心肌组织进行匀浆,采用BCA法测定总蛋白浓度后进行SDS-PAGE电泳,蛋白质以12%凝胶分离后转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭2 h,大鼠Nrf2单克隆一抗(1:1000)4℃孵育过夜,PBS冲洗后加入二抗室温下孵育3h,ECL化学发光法显影、转片、扫描;利用Photoshop软件分析蛋白印迹条带的灰度值。以目的蛋白与-actin光密度值的比值作为该目的蛋白的相对表达量。

2.4统计学方法

实验结果以X±S表示,采用One-Way ANOVA(单因素方差分析)方法,方差齐性应用LSD检验,方差不齐采用Tamhane's T2检验。P<0.05为有统计学意义。

3结果

3.1心肌缺血再灌注损伤程度的变化

与模型组比较,地尔硫卓组大鼠心肌梗死面积以及梗死区占心室面积百分比明显下降,具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,地尔硫卓组,淫羊藿总黄酮高、低剂量组大鼠心肌梗死面积以及梗死区占心室面积百分比也同样明显下降,具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表1。

3.2血清TnI含量的变化

与假手术组比较,模型组大鼠血清TnI含量明显升高,具有明显的统计学意义(P<0.01);与模型组比较,地尔硫卓组,淫羊藿总黄酮高、低剂量组大鼠血清TnI含量明显减低,具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),见表2。

3.3心肌组织中SOD和T-AOC活性及MDA含量的变化

与假手术组比较,模型组大鼠心肌组织MDA含量明显升高,SOD与T-AOC活力明显下降,具有统计学意义(P<0.01);与模型组比较,地尔硫卓组大鼠心肌组织MDA含量明显下降,同时SOD与T-AOC活力明显提高,具有统计学意义(P<0.01);同时淫羊藿总黄酮高、低剂量组大鼠心肌组织MDA含量也明显下降,SOD与T-AOC活力则有一定程度的升高,见表3。

3.4心肌组织病理学改变

假手术组大鼠心肌纤维排列整齐,结构清楚,肌束排列有序,心肌细胞无水肿;模型组动物心肌细胞水样变性明显,排列紊乱,肌束间隔增宽,间质多量炎细胞浸润。地尔硫卓组心肌细胞肥大,水样变性略减轻,轻度排列紊乱,肌束间隔略增宽,间质内可见部分炎细胞浸润。淫羊藿总黄酮组心肌细胞可见轻中度水样变性,排列无序,肌束间隔略增宽,间质有一定量的炎细胞浸润,淫羊藿总黄酮2个剂量组心肌组织病理学变化无明显的差异性改变,见图1。

3.5心肌缺血远端组织SIRT1蛋白表达的变化

与假手术组比较,模型组以及大鼠缺血远端心肌组织SIRT1蛋白表达具有一定程度的提高(P<0.05);与模型组比较,淫羊藿总黄酮高、低剂量组梗死区远端心肌组织SIRT1蛋白表达明显提高,具有统计学意义(P<0.05),见表4,图2。

3.6心肌缺血远端组织Nrf2蛋白表达的变化

与假手术组比较,模型组Nrf2蛋白表达明显降低;与模型组比较,淫羊藿总黄酮高、低剂量组Nrf2表达均显著增强(P<0.05或P<0.01),见图3,表5。

4讨论

心肌缺血再灌注损伤时,通过黄嘌呤氧化酶系统、激活的中性粒细胞、线粒体呼吸链功能异常产生大量氧自由基。大量活性氧导致的氧化应激是心肌细胞死亡、收缩与舒张功能下降的重要起始因素。在本研究中采用冠状动脉左前降支结扎法诱导心肌急性缺血再灌注的病理过程,使心肌组织处于急性缺氧/复氧状态下,由此心肌细胞线粒体电子转移障碍而产生大量的自由基。自由基蓄积过多,引起脂质、蛋白质和核酸的过氧化,使膜结构遭到破坏、蛋白降解、核酸主链断裂,最终细胞崩解,造成心肌的不可逆性损害,表现为心肌中MDA含量增加以及SOD与T-AOC活力下降;同时心肌出现大片的梗死区,心肌细胞和组织的结构呈现明显的损伤改变,与心肌损伤相关的血清标志酶TnI水平升高,其与心肌的损伤程度呈正比。因此针对心肌缺血再灌注损伤过程中氧化应激的处理措施可明显减少心肌梗死范围,保护心功能。

目前研究发现心脏组织还存在内源性抑制氧化应激反应的途径,以减少应激状态下自由基对细胞的损伤,从而改善心脏功能,成为干预氧化损伤研究的新靶点。Nrf2与Sirtl是近年来被证实的与抗氧化应激相关的转录因子,分别通过不同的通路,在调控机体氧化应激方面发挥着重要的作用。Sirtl是依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,在心脏和脑组织中分布较多,多表达在细胞核中。研究显示,细胞核中的Sirtl可能增加对心肌细胞保护功能。在氧化应激初期过程中心肌细胞中Sirtl的过表达通过Sirtl-FoxO1依赖途径或增加FoxO3和FoxO4活性以保护心肌细胞免于氧化应激损伤。中药成分白藜芦醇能通过增加细胞核中Sirtl诱导Mn-SOD生成,保护心脏减少氧化应激损伤。同样,在心肌细胞稳定表达的Nrf2也具有抗心肌细胞氧化损伤的作用。Nrf2在外来刺激作用下与其阻遏蛋白Keapl解离,再通过与抗氧化反应元件(anti-oxidant response element,ARE)结合,形成Nrt2/ARE通路,启动下游多种抗氧化蛋白类基因的表达,达到保护细胞免疫与氧化应激损伤的目的。本研究显示在心肌缺血再灌注诱导的过氧化反应过程中,与抗自由基氧化相关的Nrf2表达下降,提示心肌细胞的抗氧化能力下降,导致自由基代谢失衡,引起心肌损伤。但是结果也显示,模型组大鼠心肌SIRT1表达明显增加,说明缺血后心肌远端组织低灌注状态下的细胞呼吸链功能失常产生的过氧化物质刺激组织抗氧化应激效应出现代偿性增加,但是这种应激性的抗氧化保护作用具有一定的时效性,往往随缺血时间的延长和程度的加重逐渐减弱。

已有證实,淫羊藿及其活性成分可以明显保护大鼠心肌缺血再灌注损伤,与其抗炎和抗自由基反应相关。本研究同样显示,淫羊藿总黄酮对大鼠急性缺血再灌注引起的心肌损伤具有一定程度的保护作用,可以明显降低血清心肌酶损伤标志物TnI,减少心肌梗死的范围,减轻心肌组织形态结构的损伤。同时提高心肌组织中SOD与T-AOC抗氧化活力,相对应的减少MDA含量。进一步研究发现,淫羊藿总黄酮干预后心肌组织细胞中抗氧化因子Nrf2和Sirt1表达也明显升高,通过核转录促进组织的抗氧化效应,抑制心肌的氧化性损伤。此外本研究还提示,心肌缺血再灌注导致的脂质过氧化反应在一定程度激活了Sirt1相关的信号通路,从而促使下游的SOD等抗氧化物质的生成,部分提高了机体总抗氧化能力,发挥其在组织氧化损伤的病理条件下对心肌组织的适应性保护作用。而淫羊藿总黄酮则进一步通过促进心肌组织Nrf2和Sirt1的表达,提高机体的抗氧化能力,抑制过氧化物质的心肌细胞损伤效应,防止再灌注过程中心肌坏死的进一步发展。