元江芦荟根际放线菌的分离与鉴定

丁雅迪　缪福俊　毛德昌　吴正富　熊智

摘要：开展元江芦荟根际放线菌的研究，为促进元江芦荟的生长及品质的改良提供理论基础。采用涂布平板法对芦荟根际放线菌进行分离纯化，再对纯化的放线菌进行形态显微结构观察、生理生化及系统发育树构建分析。结果表明，从元江芦荟根际土壤中共分离鉴定出3株放线菌，属于链霉菌属的小链霉菌（Streptomyces parvus）、早期链霉菌（Streptomyces praecox）及克兰斯基链霉菌（Streptomyces krainskii）。研究结果将为芦荟病害的生物防治提供应用资源。

关键词：元江芦荟；根际放线菌；分离鉴定；系统发育树；生物防治

中图分类号：S182 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0154—04

放线菌是革兰氏阳性菌，其物种及G+C含量丰富，具有明显分枝的菌丝体，广泛分布于自然界，主要分布于土壤、海洋、植物体内及一些极端环境中。随着放线菌在人们生活中的普遍使用，赋予其巨大的市场经济价值；并且由于放线菌能够产生丰富的生物活性物質，其中包含大量抗生素，使其具有较强的生物修复能力，目前有2/3的抗生素被广泛应用于农业、林业和临床医学等方面。近年来，随着人们对植物根际区域研究的不断深入，发现从放线菌的天然栖居地土壤中仅能分离出1/10的放线菌，而根际土壤中含有大量微生物类群，其数量远多于非根际土壤中的微生物类群。根际土壤放线菌形成的生物活性物质也明显高于非根际土壤放线菌，根际土壤放线菌不仅能够分解土壤有机质，为植物制造养料，还具有产生碳酸气、有机酸的能力，使土壤中难溶性物质溶解。因此，开展根际土壤放线菌的研究意义重大，有望开辟放线菌新药物及具有活性的次级代谢产物的新资源。目前对植物根际放线菌研究不多，主要集中于海洋放线菌、植物内生放线菌、特殊环境放线菌等方面，国内外针对元江芦荟根际放线菌的研究未有报道。芦荟因具有药用、食用、美容及保健等方面的功能而得到广泛应用，主要分布于云南、广东、海南、四川、福建等热带地区。本研究选择云南元江芦荟（Aloe yuanjiangensis）根际土壤作为研究对象，采用选择性分离方法、形态结构特征观察法、生理生化性质分析法及系统发育树分析法对放线菌进行鉴定，以期为后期优化出拮抗芦荟根腐病病原菌的放线菌奠定基础，并提高其在农林保护及医学研究等方面的应用价值。

1材料与方法

1.1试验材料

选取云南野生元江芦荟（A.yuanjiangensis）种植地作为目标地，采集10份根际混合土样作为分离样品，实验室自然风干备用。

主要培养基为：高氏一号培养基，配方参见文献[22]；TWYE培养基（0.025%酵母浸膏，0.05%K2HP04，1.8%琼脂，加水至1000 mL，调节pH值为7.2）、YIM38号培养基（0.4%酵母浸膏，0.4%葡萄糖，0.5%麦芽膏，微量复合维生素，1 mL微量盐，1.5%琼脂，加水至1 000 mL，调节pH值为7.2）。为抑制细菌生长，倒平板前分别于上述3种培养基中加入3.3 mL无菌0.01%重铬酸钾溶液。

1.2主要仪器

主要仪器有：微波炉（格兰仕）；高压蒸汽灭菌锅（上海博迅实业有限公司）；冷冻型台式高速离心机（MIKRO 220R）；普通离心机（德国艾本德）；超净工作台（Airtech）；恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）；水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；光学显微镜（上海比目仪器有限公司）；凝胶成像系统（英国Syngene）；PCR自动系列化分析仪（德国Biome-tra）。

1.3试验万法

1.3.1土壤稀释液的制备 称取1 g自然风干的健康芦荟根际土壤，研钵碾碎过筛，高温烘干（100℃，1 h），加入已准备好的带有磁珠的99 mL无菌水中，低速摇床（170 r/min，30℃）处理1 h，再微波处理30 s，混匀后即得稀释100倍的土壤悬液。取1 mL稀释100倍的土壤悬液加入到含有9 mL无菌水的试管中，摇匀即得稀释1000倍的土壤悬液。再取1 mL稀释1 000倍的土壤悬液同样加入到含有9 mL无菌水的试管中，摇匀后得到稀释1万倍的土壤悬液。根据此法依次得到稀释10万倍、100万倍的土壤悬液。

1.3.2放线菌的分离纯化 采用涂布平板法吸取1 mL稀释1万倍的健康芦荟根际土壤稀释液，依次涂布于高氏一号、TWYE、YIM38号平板中。稀释10万倍、100万倍的健康芦荟根际土壤稀释液采用同种方法涂布。28℃下恒温培养7～15 d。将分离出的放线菌菌落挑出，经过多次纯化接种到相应斜面培养基中保存，置于4℃冰箱中保存备用。

1.3.3放线菌的形态鉴定 采用分区划线法观察放线菌菌落特征，采用插片法观察放线菌的形态特征，用无菌镊子取数块无菌盖片，以45°角分别斜插于接有放线菌的高氏一号、TWYE、YIM38号平板，每个平板插4片，28℃培养5～7 d，结晶紫染色显微镜下观察拍照。

1.3.4生理生化鉴定 按照梁银等的方法对放线菌进行常规酶学性质的研究，并对碳源利用情况进行研究。

1.3.5菌株DNA的提取及系统发育树构建 采用酶解法小量提取芦荟健康根际放线菌DNA。25 IxL PCR反应体系：各1μLPA、PB，12.5μL 2×Taq PCR Master Mix，1 μL DNA模板，ddH₂O补足至25μL。16 s rDNA PCR扩增常用引物及扩增条件参照陈森洲等方法。取4.0μLPCR扩增产物通过1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，其余产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司纯化并测序。采用MEGA5.1软件进行多序列的比对，对比对结果进行系统发育树的构建，以确定菌株的种属地位。

2结果与分析

2.1放线菌分离的鉴定

从芦荟根际土壤中共分离得到3株放线菌，依次命名为LHFXJ01、LHFXJ02、LHFXJ03。对这3株放线菌进行培养发现，菌株生长缓慢，菌落密集如毡、具粉状凸起及明显褶皱，菌落小而不扩散（图1）。气生菌丝呈现乳白色、灰色、黄白色，基质菌丝的颜色呈现黄色、灰色，可溶性色素包括黄色、灰白色。显微镜下观察可知：菌丝细且发达，逐渐形成孢子丝；孢子丝或长而直，或短而柔曲；孢子成熟后脱落，形成具椭圆形、卵圆形、球形等孢子（图2）。因此结合培养特征、形态特征初步判定这3株放线菌为链霉菌属（Streptomyces sp.）的不同种。

2.2生理生化特性鉴定

采用常规酶学指标检测试验对菌株LHFXJ01、LHFXJ02、LHFXJ03生理生化性质进行检测。由表1可知，3株放线菌均能使明胶液化、牛奶胨化、淀粉水解、硝酸盐还原、纤维素水解，只是部分菌株作用效果缓慢。除菌株LHFXJ02使牛奶凝集慢，其他菌株不能使牛奶凝集。3株菌均能够利用D-葡萄糖、D-甘露醇、L-阿拉伯糖，不能利用蔗糖、棉子糖和肌醇作为碳源，其中菌株LHFXJ01、LHFXJ02还能够利用D-果糖、D-木糖、鼠李糖作为碳源，菌株LHFXJ03则不能。这些结果与链霉菌属特征吻合。

2.3放线菌16SrDNA PCR扩增及序列测定

芦荟根际放线菌的16S rDNA经PCR扩增，获得1500 bp左右PCR产物，扩增结果见图3，剩余产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。所得菌株16S rDNA序列在GenBank中注册，获得GenBank登录号（KR258748-KR258750）。

2.4系统发育树的构建

将序列提交至NCBI中的GenBank中进行BLAST同源比对，选取同源性最高的序列进行多序列比对，通过MEGA 5.1使用最大简约性法（maximum parsimony）构建系统发育树，确定该菌株的种属地位。从图4、表2可以看出，青霉属（Peni-cillum sp.）（KJ527027）为外类群，从系统发育树中可以看出LHFXJ01（KR258748）与小链霉菌（Streptomyces parvus）（JX203385.1）在同一个系统发育分支，相似度为99.9%；LH-FXJ02（KR258749）与早期链霉菌（Streptomyces praecox）（JQ924403.1）在同一个系统发育分支，相似度为99.8%；LH-FXJ03（KR258750）與克兰斯基链霉菌（Streptomyces krainskii）（ABl84278.1）在同一个系统发育分支，相似度为99.9%。可以判定LHFXJ01（KR258748）为Streptomyces parvus（JX203385.1）；LHFXJ02（KR258749）为Streptomyces praecox（JQ924403.1）；LHFXJ03（KR258750）为Streptomyces krainskii（AB184278.1）。

3结论与讨论

经培养特征、形态结构特征、部分常规生理生化性质及系统发育分析相结合的方法进行鉴定，结果表明，分离的3株放线菌属于链霉菌属（Streptomyces sp.）的3个种，分别为Strep-tomyces parvus、Streptomyces praecox、Streptomyces krainskii。这将有助于探索防治芦荟病害的生物途径，使芦荟具有更高的医疗、美容、保健、食用等价值。

分离纯化的3株放线菌都是链霉菌属，这与廖振林等从广西北海红树林土壤中分离到链霉菌属占4/5的结论。一致；也符合司美茹等从济宁市土壤放线菌中分离得到链霉菌属占70%以上的研究结果。本试验中未分离纯化出放线菌的其他种属，可能与土样的预处理、培养基的选择、采样时间、地点及分离方法等方面因素有关，有待进一步研究。

链霉菌属菌株可为人类源源不断地提供天然活性物质，能够提供约占临床医学67%的具有重大应用价值的抗生素。前人研究表明：链霉菌属产生的生物活性物质包括抗菌剂、免疫抑制剂、抗肿瘤剂、抗虫剂等。随着土壤中放线菌菌株的不断发现，从这些普通环境中探索出新的生物活性物质产生菌难度日益增大，随着人类对活性物质需求的不断增多，加速了探索新的活性物质领域的进程。本试验未对从芦荟根际土壤中分离纯化的3株链霉菌属菌株进行生物活性物质及抗菌能力测定，芦荟根际放线菌菌株链霉菌属具备产生何种生物活性物质的能力还有待于进一步深入研究。