基于SRAP标记的湘产百合核心种质库构建

童巧珍+高昱+刘平安+蔡嘉洛+张亚利+樊悦+易刚强

摘要：利用相关序列扩增多态性（sRAP）標记技术，以45份初级种质代表的87份湘产百合种质为材料，通过Pop-Gene32、NTSYS-Pc（Version 2.1）等软件筛选湘产百合核心种质。结果表明：共获得多态位点218个，物种水平上多态性比例78.42%；通过对SRAP信息进行遗传多样性分析，使用逐步聚类取样法和分层抽样法筛选出15份核心种质，占收集资源总数的17.2%；t检验表明，核心种质的有效等位基因数、Neis遗传多样性指数、Shannons信息指数在0.05水平上与初始种质差异不显著，说明核心种质能很好地代替初始种质。

关键词：湖南省；百合；核心种质；遗传多样性；SRAP；种质资源

中图分类号：S682.2⁺90.24 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—056—04

湖南省为我国百合主要产区之一，百合在湖南省各地均有分布，以湘西自治州龙山县的龙山百合、邵阳市隆回县的龙牙百合种植区域最广。百合集药用、食用、观赏用途为一体，具有很高的经济价值。面对日益增长的百合需求，保护和利用百合种质资源极为重要。近年来，种质资源研究在国内外兴起，核心种质作为种质资源群体研究和利用的切入点，开展相关研究可以避免遗传上的重复，从而保存丰富的遗传变异，是提高种质资源利用率的有效途径，但是核心种质研究大多集中在牡丹、烟草、水稻等作物上，湘产百合核心种质研究尚未见报道。依靠基因型信息处理获得的核心种质，主要通过简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、ISSR、扩增片段长度多态性（AFLP）等分子标记方法来实现，这些方法具有准确、高效、不受外界环境以及基因间互作影响等特点，能被很好地用来构建核心种质。相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism，SRAP）是在RAPD基础上的升级，引物高度通用，比AFLP更能反映形态学变异和进化历史，同时该技术还被认为是在分子标记辅助育种中最可能被大规模应用的一种技术。本研究利用SRAP标记技术筛选湘产百合核心种质，以期为有效利用其优秀基因提供依据。

1材料与方法

1.1材料

87份百合种质采自湖南省各地区，根据地方品种来源进行分组，按约50%的总体取样比例抽取45份样本建立初级核心种质（primary core collection），采用SRAP分子标记信息数据。45份初级种质来源及分组信息见表1。

1.2方法

1.2.1分子标记方法 根据改良CTAB法提取湘产百合种质DNA，参照Ⅱ等的原则，并作适当改进获得反应体系。SRAP-PCR扩增反应体系为20μL，其中Mg²⁺浓度2.5 mmol/L，dNTPs浓度0.2μmol/L，引物浓度0.2μmol/L，Taq酶1U，模板DNA 50 ng。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，37℃复性1 min，72℃延伸2 min，5个循环；94℃变性1 min，50℃复性1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离（0.5×TBE，80 V，100 min），凝胶成像系统观察、照相。

1.2.2核心种质构建方法

1.2.2.1逐步聚类取样法 采用逐步聚类随机取样法，根据45份样本建立的初级核心种质SRAP信息的不加权类平均法（UPGMA）聚类结果，删除遗传相似系数最大的2份种质中的1份（如组内只有1份遗传材料，则选取该遗传材料），将剩余种质再聚类；再从遗传相似系数最大的成对种质中删除1份。以此类推，直到代表性或核心种质数量达到要求。利用上述方法分别设定50%、35%、20%的取样比例，分别获得样本群P₁、P₂、P₃。样本群P₁（23个样本）编号：1、4、5、6、8、11、14、15、16、20、27、31、34、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45；样本群P₂（15个样本）编号：1、4、8、11、20、27、34、36、37、39、40、41、42、43、45；样本群P₃（9个样本）编号：1、4、11、20、27、34、37、40、43。

1.2.2.2分层抽样法 采用分组取样策略，参考黎毛毛等的方法并适当改进，组内及亚组内取样方法采用聚类、随机方法相结合。根据主产区域将45份样本建立的初级核心种质分为湘北、湘西北、湘西南、湘中南等4个区域组。

抽样方法1：按50%比例在各区域组抽取一定数量的种质构成取样组；在取样组内对SRAP信息进行遗传多样性和聚类分析，依据遗传相似性阈值划分为不同的亚组，在各亚组内随机抽取一定数量的种质构成样本群P₄。

抽样方法2：根据各区域组的种质规模，抽取一定数额的种质构成取样组（对百合种质数量多的，抽取比例可适当小一些；对百合种质数量少的，抽取比例可相对大一些）；在取样组内对SRAP信息进行遗传多样性和聚类分析，依据遗传相似性阈值划分为不同的亚组，在各亚组内按50%比例随机抽取一定数量的种质构成样本群P₅。

2.3核心种质的评价

将初级核心种质余下的30份样品作为保留种质，通过对比核心种质与保留种质，核心种质保留87份百合样品中的15份样品（17.2%），很好地保留了多态位点，各项指标明显优于保留种质（表4）。表明由初级种质中抽取的15份核心种质很好地保留了初级种质的遗传多样性，保留种质中因减少了遗传距离较大的种质，导致各指标明显降低。

利用SPSS 17.0软件对有效等位基因数、Neis基因多样性指数、Shannons信息指数进行t检验。由表5可见，核心种质与初始种质的有效等位基因数、Neis基因多样性指数、Shannon's信息指数在0.05水平上差异不显著，核心种质能很好地代替初始种质。

3结论与讨论

3.1核心种质的代表性、异质性、多样性

构建湘产百合核心种质要满足代表性、异质性、多样性的需求，尽可能地对各地区广泛取样，使其具有较好的代表性、多样性；但是对主要产区取样须考虑相互引种、种内基因交流、遗传变异及优良品种推广等因素；为获得更多的多态位点，应适当扩大主要产区的取样，筛除相似种质，优选多样性种质。本研究表明，来自龙山县洗洛乡编号为27、34的样本问遗传距离为0.503 7，SRAP分子数据显示为较大的遗传差异，说明扩大主要产区内取样的必要性，以避免漏选；最终确定核心种质时，不能忽略各地区百合种质因杂交和基因变异对多样性的影响，须确定1个相对固定的遗传相似性阈值，对最终核心种质各地区种质所占份额进行调整，以保证湘产百合的代表性和异质性。SRAP扩增获得278个位点，其中218个具有多态性，满足了核心种质遗传多样性需求。

3.2核心种质取样方法

核心种质含15份样品，其中3份种质来自湘东北地区，占湘东北地区种质数量的42.9%，占核心种质数量的20%；5份种质来自湘中南地区，占湘中南地区种质数量的62.5%，占核心种质数量的33.3%；3份种质来自湘西南地区，占湘西南地区种质数量的33.3%，占核心种质数量的20%；4份种植来自湘西北地区，占湘西北地区种质数量的19.0%，占核心种质数量的26.7%。该来源分布符合核心种质代表各区域遗传分布的基本需求。湘西北地区的龙山县、湘西南地区的隆回县为湖南省百合主要产区，本研究在上述2个地区采样较多，在龙山县采样31份，采样量占湘西北地区采样量的72.6%，根据50%的取样原则，其中16份人选初级种质；在隆回县采样10份，采样量占湘西南地区采样量的55.6%，其中5份人选初级种质。因此，区域组内部分种质问会具有很高的遗传相似性，且相似种质数量较多，但根据76.37%的遗传变异存在于地域内的分析结果，又表明区域组内具有较大的遗传差异，少部分种质对区域组内的遗传多样性有很大影响。因此，有必要依据遗传相似性阈值将其划分为不同的亚组，以说明地域内的遗传分化及各样本对区域组遗传多样性的影响，再利用50%比例在各亚组内随机抽取一定数量的种质构成样本群。通过该方法筛选，减少了样本数量对筛选结果的影响，以50%比例亚组抽取比例，又进一步确定了核心种质的规模，使各区域组间所选取的样本遗传相似性较大的种质人选数量减少，所取得的群体更具有代表性，也结合百合种质相互引种和优良品种推广种植而导致各区域组内存在较大的遗传变异的结论，避免相似种质入选概率。

3.3核心种质的取样比例

在确定核心种质所含样本总量时，须结合所收集样本的总体数量选择恰当的抽样比。我国有悠久的百合使用历史，人工选择对物种进化有很大影响，核心种质构建的抽样过程中，须更多地平衡推广品种与野生自然品种、区域特有品种的抽样比例；对多态性好的群组，在抽取比例选取时可扩大其在核心种质中的比例。多数植物核心种质的抽样比例为全部收集种质的5%～30%，一般为10%左右，但较小种质资源群体保存的遗传变异和结构对抽样比更为敏感。湘产百合核心种质选用逐步聚类取样法和分层抽样法选取多个抽样比50%、35%、20%，最终优选出15个样本构成核心种质，占收集百合种质总量的17.2%，符合构建核心种质的要求。

3.4结论

通过分层抽样法使用SRAP分子标记信息，优选出的核心种质保存218个多态位点中的218个，保留率100%，多态性比例78.42%，观测等位基因数1.784 2个，有效等位基因數1.531 0个，Neis基因多样性指数0.305 5，Shannons信息指数0.448 8。通过遗传多样性分析和t检验，认为所建立的湘产百合核心种质很好地代表了初级核心种质，又很好地代表了湖南省各地区的百合遗传变异，核心种质群体的差异性和多样性很高，具有很大的保存意义。