丝素降解生成的低分子多肽对细胞生长性能的影响

王富平，庞亚妮，陈忠敏

(重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆400054)

研究与技术

丝素降解生成的低分子多肽对细胞生长性能的影响

王富平，庞亚妮，陈忠敏

(重庆理工大学 药学与生物工程学院，重庆400054)

分析丝素降解生成的低分子多肽(low-molecular-weight silk fibroin peptides，LMW-SF)对细胞生长的影响。LMW-SF通过中性蛋白酶酶解丝素蛋白(silk fibroin，SF)获得，分别采用过滤除菌和高压蒸汽灭菌处理后，在0.1～5.0 mg/mL体积浓度条件下，检测LMW-SF对人正常肝细胞(L02)、人肝癌细胞(HepG2)的生长影响，计算相对增殖率(relative growth rate，RGR)。结果显示：当LMW-SF体积浓度较低(0.1 mg/mL和0.5 mg/mL)时，LMW-SF对细胞生长影响较小；当其体积浓度较高(2.5 mg/mL和5.0 mg/mL)时，RGR值最低至8.3%，呈强抑制细胞生长作用；高压蒸汽灭菌处理后，RGR最高达227.4%，呈强促细胞生长作用。研究结果表明：高压蒸汽处理可以使LMW-SF变性失活，并实现强促细胞生长作用，可成为蛋白类物质应用于组织工程支架时的必需工艺环节。

低分子丝素蛋白多肽；酶解；过滤除菌；高压蒸汽灭菌；细胞生长

丝素蛋白(silk fibroin, SF)作为一种从蚕茧中提取的天然纤维蛋白质，因其良好的生物相容性、生物降解性被广泛应用于生物医用材料领域，如固定化酶材料[1]、细胞培养基质[2]、药物缓释剂[3]、组织工程支架[4]等。丝素蛋白作为组织工程支架时，具有促进细胞在材料表面的黏附能力[5]。同时，在体内生理环境下发生降解[6]，其中蛋白酶XIV起着非常关键的作用[7-8]，酶解产物以游离氨基酸和低分子多肽为主，可被细胞新陈代谢所利用，可促进细胞增殖[9-10]，即经过降解的丝素蛋白带上了犹如生长因子的作用，在组织工程支架领域具备了优异的特性。

有文献对丝素蛋白促细胞生长机理进行了探讨，认为其需经过酶解后再被细胞利用[11]，因此，如果先将家蚕丝素酶解成低分子多肽(low-molecular-weight silk fibroin peptides，LMW-SF)，就可以提高细胞的利用效率，能更快速地促进细胞生长。但是，部分研究指出，由于丝素蛋白中含有0.45%左右的半胱氨酸(Cys)[12]，当丝素蛋白酶解至低分子多肽时，Cys可能会形成二硫键，多肽二级结构将发生改变，可能会使其具备活性[13-14]，而这类活性可能会对细胞生长造成负面影响。由此，在前期本课题组使用中性蛋白酶酶解获得LMW-SF的基础上，本文拟研究丝素蛋白水解为低分子多肽时其体积浓度的变化对细胞生长的影响。由于高压蒸汽方法能造成丝素蛋白变性，本文即对比性地采用过滤除菌法和高压蒸汽法来处理LMW-SF，研究处理后LMW-SF对细胞生长的影响，为丝素蛋白更广泛应用于生物医用材料提供科学基础依据。

1 实 验

1.1 材料和试剂

茧壳(重庆市纤维织品检验所)，透析袋(USA进口分装，标定截留分子量MW为8 000～14 000)，中性蛋白酶(南宁庞博生物有限公司，酶活力20×104U/g)，小鼠成纤维细胞L929(第三军医大学)，人正常肝细胞L02、人肝癌细胞HepG2(上海中乔新舟生物科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，RPMI-1640培养基、DMEM培养基、HyClone(赛默飞世尔生物化学制品有限公司)，氨苄青霉素、硫酸链霉素、MTT(北京Solarbio生物科技有限公司)，所用试剂Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、二甲亚砜(DMSO)等均为分析纯(市售)。

1.2 制备低分子丝素蛋白多肽

按照文献[15]的方法，采用盐溶法经透析、浓缩和冷冻干燥得到SF粉末，密封保存备用，扫描电镜检测其线粒大小为20～50 μm。采用中性蛋白酶酶解法得到LMW-SF粉末，密封保存备用。

1.3 过滤除菌法对LMW-SF体积浓度的影响

配制体积浓度适中的LMW-SF水溶液，使其峰值吸光度介于0.5～0.7，采用UV-29200型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)测定240～320 nm的吸光度，确定LMW-SF的峰值波长，并将此波长下吸光度数值在过滤(微孔滤器，220 nm，Millipore，Ireland)前后进行对比。

1.4 细胞生长性能检测

L02细胞用RPMI-1640培养基培养，HepG2细胞用DMEM培养基培养。配制体积浓度为5 mg/mL的LMW-SF水溶液，采用过滤除菌法(微孔滤器，220 nm，Millipore，Ireland)和高压蒸汽法(高压自动灭菌锅，YXQ-LS-50G，上海博迅)处理，在处理后用完全培养基分别稀释成0.1、0.5、2.5、5.0 mg/mL四种体积浓度。用血球计数板分别将两种细胞浓度调节为2×105个/mL，以每孔100 μL加入到96孔板(Corning，USA)中，过夜待细胞贴壁后吸走孔内液体，然后每孔加入200 μL制备好的含不同体积浓度的LMW-SF培养基，以只加完全培养基的孔作为空白对照组，每组试验设置3个复孔，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱(FORMA3111,美国Thermo公司)中培养。分别于12、24、36、48、60 h后采用MTT法检测两种细胞的活性：每孔加入20 μL MTT，于细胞培养箱中继续培养4 h后，弃去96孔板中的液体，每孔加入150 μL DMSO，使用酶标仪(Multiskan GO，美国Thermo公司)震荡10 min，然后检测其在490 nm处的吸光值绘制细胞生长曲线，并按照下式计算相对增殖率RGR。

(1)

2 结果与分析

2.1 过滤除菌对LMW-SF吸光度影响

蛋白质在紫外有两个特征吸收峰，一是由于其含色氨酸残基和酪氨酸残基，其分子内部存在着共轭双键，在280 nm处有一吸收峰；二是因肽键存在而引起的，在200～220 nm处有一吸收峰，此两处吸收峰都可用于蛋白质的定量测定，但以前者为常用。经检测LMW-SF在275 nm时存在最大吸收峰，220 nm微孔滤器过滤后使得LMW-SF浓度略有减低(图1)，峰值吸光度从0.644减低至0.623，减低至96.7%，显示过滤对NSF浓度影响较小。

2.2 过滤除菌处理后LMW-SF对细胞生长影响

220 nm微孔滤器过滤后，在细胞培养过程中，为保证细胞生长的安全性，在完全培养基中加入了1%双抗，LMW-SF对L02、HepG2细胞生长的影响如图2所示。当LMW-SF体积浓度较低(0.1 mg/mL和0.5 mg/mL)时，LMW-SF对两种细胞生长影响较小；当LMW-SF体积浓度较高(2.5 mg/mL和5.0 mg/mL)时，LMW-SF对两种细胞生长存在抑制作用。以5.0 mg/mL为例，L02、HepG2细胞生长的RGR值分别为23.83%±0.92%、8.03%±0.91%，呈强抑制细胞生长作用，同时随着体积浓度的增加，对细胞生长抑制作用越强。

LMW-SF是酶解产物，呈水溶性，可溶解分散于细胞培养基中。由于中性蛋白酶酶切位点无特定性，LMW-SF的产物即属于复杂的多肽、游离氨基酸混合物。过滤除菌法是一种物理过滤的方法，不会影响到LMW-SF的结构特性。研究发现，当LMW-SF在高体积浓度条件下对细胞呈现出强抑制的作用，而游离氨基酸对细胞应是具有营养价值，具有促生长作用的。这说明在LMW-SF的混合物中存在某一种或者某些组分，会随着体积浓度的提高而抑制细胞生长，而且该作用具有浓度依赖性，当其浓度达到最低有效作用浓度时，就会对细胞呈抑制作用。这个结果显示，酶解后的丝素蛋白在应用于组织工程领域生物支架制备时，其含量需要深入研究。

2.3 高压蒸汽处理后LMW-SF对细胞生长影响

LMW-SF在高压蒸汽处理后对L02、HepG2细胞生长的影响如图3所示。当LMW-SF体积浓度较低(0.1 mg/mL和0.5 mg/mL)时，LMW-SF对两种细胞的生长存在微弱促进作用；LMW-SF体积浓度较高(2.5 mg/mL和5.0 mg/mL)时，LMW-SF对人种细胞L02、HepG2呈强促细胞生长作用，RGR分别为227.4%±8.35%、145.2%±4.77%，且细胞生长呈浓度依赖性。

图2 过滤除菌后LMW-SF对细胞生长的影响Fig.2 The effect of LMW-SF on cell growth after filtration sterilization

图3 高压蒸汽灭菌后LMW-SF对细胞生长的影响Fig.3 The effect of LMW-SF on cell growth after high-pressure steam sterilization

2.4 两种处理方式下的相对增殖率对比

如图4所示，经过过滤除菌后的LMW-SF，在较高体积浓度条件下存在着抑制细胞生长的活性物质组分；当其经过高压蒸汽处理后，LMW-SF呈现出强促进细胞生长的作用，对细胞生长产生了截然相反的作用效果，且存在细胞差异。分析认为，由于高压蒸汽处理法中蒸汽潜热大、穿透力强，容易使蛋白质LMW-SF变性或凝固，就可能破坏了LMW-SF混合性组分中具有生物活性效能分子的结构。因此，当LMW-SF应用于生物材料基材时，需要经过高压蒸汽处理，而高压蒸汽处理工艺也正是材料灭菌时可以采用的方法。

图4 两种灭菌方式下的相对增殖率比较Fig.4 The comparison of RGR under two types of sterilization

3 结 论

中性蛋白酶酶解丝素蛋白后，形成了游离氨基酸和多肽的混合性物质，其中存在着具有抑制细胞生长的组分，且该组分可通过高压蒸汽处理法使其变性失活，变抑制为显著促进细胞生长。因此，在将酶解后的丝素蛋白应用于组织工程支架时，高压蒸汽灭菌法是必需的工艺环节。

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Effect of low-molecular-weight silk fibroin peptides on cell growth property

WANG Fuping, PANG Yani, CHEN Zhongmin

(College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

The main purpose of this paper is to analyze the effects of low-molecular-weight silk fibroin peptides (LMW-SF) on cell growth characteristics. Firstly, LMW-SF was achieved from silk fibroin enzymolysis by neutral protease. Secondly, LMW-SF was sterilized by filtration and high-pressure steam, respectively. Finally, the effects of LMW-SF on the growth of human normal liver cell (L02) and human liver cancer cell (HepG2) were tested under the volume concentration of 0.1～5.0 mg/mL, and the relative growth rate (RGR) was calculated. The results show that LMW-SF have slight effect on cell growth at low concentration (0.1 mg/mL and 0.5 mg/mL); when the volume concentration is high (2.5 mg/mL and 5.0 mg/mL), the lowest value of RGR is 8.3%, indicating a strong inhibition effect on cell growth. RGR is up to 227.4% after high-pressure steam sterilization, showing a strong promotion effect on cell growth. It is obvious that LMW-SF have a strong effect on promoting cell growth after high-pressure steam sterilization, and high-pressure steam sterilization could be a necessary process when protein is applied in tissue engineering scaffolds.

low-molecular-weight silk fibroin peptides; enzymolysis; filtration sterilization; high-pressure steam sterilization; cell growth

10.3969/j.issn.1001-7003.2017.04.001

2016-06-15;

2017-03-13

重庆市科委(csct2014jcyja10018)；重庆市教委(KJ1400916)

王富平(1982-)，男，副教授，博士，主要从事生物医用材料的研究。

R318.08

A

1001-7003(2017)04-0001-04 引用页码:041101